1. Inledande förståelse

I det här skedet måste vi förstå vissa begrepp och terminologi, för att undvika att göra misstag inför våra seniorer, som:

F: Vad är skillnaden mellan RT-PCR, qPCR, Realtids-PCR och realtids-RT-PCR?

Svar: RT-PCR är omvänd transkriptions-PCR(omvänd transkriptions-PCR, RT-PCR), som är en flitigt använd variant av polymeraskedjereaktion (PCR).I RT-PCR transkriberas en RNA-sträng omvänt till komplementärt DNA, som sedan används som mall för DNA-amplifiering genom PCR.
Realtids-PCR och qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) är samma sak, båda är kvantitativa realtids-PCR, vilket innebär att varje PCR-cykel har realtidsdataposter, så antalet startmallar kan justeras exakt analys.

Även om både realtids-PCR (realtidsfluorescerande kvantitativ PCR) och omvänd transkriptions-PCR (omvänd transkriptions-PCR) verkar vara förkortade som RT-PCR, är den internationella konventionen: RT-PCR hänvisar specifikt till omvänd transkriptionPCR, realtids-PCR förkortas generellt som qPCR (kvantitativ realtids-PCR).

Och realtids-RT-PCR (RT-qPCR), det är omvänd transkriptions-PCR kombinerat med den fluorescerande kvantitativa teknologin: först skaffa cDNA (RT) från RNA omvänd transkription och använd sedan realtids-PCR för kvantitativ analys (qPCR).De flesta laboratorier gör RT-qPCR, det vill säga forskning om RNA-uttryck nedreglering, så qPCR som alla pratar om i laboratoriet refererar faktiskt till RT-qPCR, men glöm inte att det fortfarande finns många DNA-tester i kliniska tillämpningar.Kvantitativ analys, såsom detektering av hepatit B-virus HBV.

Fråga: Efter att ha läst mycket fluorescerande kvantitativ PCR, varför ska det amplifierade fragmentet kontrolleras inom intervallet 80-300bp?

Svar: Längden på varje gensekvens är olika, vissa är flera kb, vissa är hundratals bp, men vi behöver bara kräva att produktlängden ska vara 80-300bp när vi designar primers, för korta eller för långa är inte lämpliga för fluorescerande kvantitativ PCR-detektion.Produktfragmentet är för kort för att kunna särskiljas från primer-dimeren.Längden på primer-dimeren är cirka 30-40 bp, och det är svårt att särskilja om det är en primer-dimer eller en produkt om den är mindre än 80 bp.Om produktfragmentet är för långt, överstiger 300 bp, kommer det lätt att leda till låg amplifieringseffektivitet och kan inte effektivt detektera mängden av genen.

När du till exempel räknar hur många som är i ett klassrum behöver du bara räkna hur många munnar det finns.Detsamma gäller när du upptäcker gener, du behöver bara upptäcka en viss sekvens av en gen för att representera. Hela sekvensen duger.Om du vill räkna människor måste du räkna både mun och näsa, öron och glasögon, och det är lätt att göra misstag.

För att utöka, inom biologisk forskning, finns det många forskningsfall från punkt till område, eftersom gensekvensen för alla arter är mycket lång, är det onödigt och omöjligt att mäta alla fragment, såsom bakteriell 16S-sekvensering, vilket är att utföra den konservativa sekvensen av bakterier Analyser för att sluta sig till antalet av en viss population av bakterier.

F: Vilken är den optimala längden för qPCR-primerdesign?

Svar: Generellt sett är primerlängden cirka 20-24bp, vilket är bättre.Naturligtvis måste vi vara uppmärksamma på primerns TM-värde när vi designar primern, eftersom detta är relaterat till den optimala glödgningstemperaturen.Efter många experiment har det bevisats att 60°C är ett bättre TM-värde.Om glödgningstemperaturen är för låg leder det lätt till ospecifik amplifiering.Om glödgningstemperaturen är för hög kommer amplifieringseffektiviteten att vara relativt låg, toppen av amplifieringskurvan kommer att börja senare och CT-värdet kommer att försenas.

F: Hur skiljer sig färgmetoden från sondmetoden?

Svar: FärgningsmetodVissa fluorescerande färgämnen, såsom SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, etc., avger inte ljus av sig själva, men kommer att avge fluorescens efter bindning till den mindre skåran av dubbelsträngat DNA.Därför, i början av PCR-reaktionen, kan maskinen inte detektera den fluorescerande signalen.När reaktionen når hybridiserings-förlängningsstadiet öppnas dubbelsträngen och en ny sträng syntetiseras under inverkan av DNA-polymeras, och den fluorescerande molekylen binder till dsDNA-minor groove.När antalet PCR-cykler ökar, kombineras fler och fler färgämnen med dubbelsträngat DNA, och den fluorescerande signalen förstärks också kontinuerligt.Färgningsmetoden används främst inom vetenskaplig forskning.
PS: Var försiktig när du gör experimentet, färgämnet måste kombineras med mänskligt DNA, var noga med att förvandla det till en fluorescerande person.

Färgningsmetod (vänster) Sondmetod (höger)
PS: Var försiktig när du gör experimentet, färgämnet måste kombineras med mänskligt DNA, var noga med att förvandla det till en fluorescerande person.

SYBR Green Ⅰ binder till den mindre skåran i DNA

SondmetodTaqman-sonden är den mest använda hydrolyssonden.Det finns en fluorescerande grupp vid 5′-änden av sonden, vanligtvis FAM, och själva sonden är en sekvens som är komplementär till målgenen.Det finns en fluorescerande släckningsgrupp i 3′-änden.Enligt principen för fluorescensresonansenergiöverföring (Förster resonance energy transfer, FRET), när reporterfluorescensgruppen (donatorfluorescerande molekyl) och den släckande fluorescerande gruppen (acceptorfluorescerande molekylen) exciteras När spektra överlappar och avståndet är mycket nära (7-10 fluorescerande fluorescerande molekyl) är exciterade. acceptormolekylen, medan autofluorescensen försvagas.Därför, i början av PCR-reaktionen, när sonden är fri och intakt i systemet, kommer den fluorescerande reportergruppen inte att avge fluorescens.Vid hybridisering binder primern och sonden till mallen.Under förlängningssteget syntetiserar polymeraset kontinuerligt nya kedjor.DNA-polymeras har 5′-3′ exonukleasaktivitet.När det når sonden kommer DNA-polymeraset att hydrolysera sonden från mallen, separera reporterfluorescerande gruppen från quencher-fluorescerande gruppen och frigöra den fluorescerande signalen.Eftersom det finns ett en-till-en-förhållande mellan sonden och mallen, är sondmetoden överlägsen färgmetoden när det gäller testets noggrannhet och känslighet.Sondmetoden används främst vid diagnos.

F: Vad är absolut kvantifiering?Vad är relativ kvantifiering?

Svar: Absolut kvantifiering avser beräkningen av det initiala kopiantalet för provet som ska testas med qPCR, till exempel hur många HBV-virus som finns i 1 ml blod.Resultatet som erhålls genom relativ kvantifiering är förändringen i mängden av målgenen i ett specifikt prov i förhållande till ett annat referensprov, och genuttrycket är uppreglerat eller nedreglerat.

F: Kommer mängden RNA-extraktion, omvänd transkriptionseffektivitet och amplifieringseffektivitet att påverka de experimentella resultaten?
F: Kommer provlagring, extraktionsreagenser, omvänd transkriptionsreagens och ljustransmitterande förbrukningsmaterial att påverka experimentresultaten?
F: Vilken metod kan korrigera experimentdata?

Angående dessa problem kommer vi att beskriva dem i detalj i de avancerade och avancerade avsnitten nedan.
2. Avancerad kunskap

När det gäller fluorescerande kvantitativ PCR i realtid måste vi erkänna verkligheten att tusentals vetenskapliga forskningsartiklar publiceras varje år, bland vilka den fluorescerande kvantitativa PCR-tekniken inte är ett litet antal.

Om det inte finns någon gemensam standard för att mäta det fluorescerande kvantitativa PCR-experimentet, kan resultaten variera kraftigt.För samma gen av samma art, med samma bearbetningsmetod, kommer detektionsresultaten också att variera kraftigt, och det kommer att vara svårt för senkomlingar att upprepa samma resultat.Du Ingen vet vad som är rätt och vilket som är fel.

Betyder detta att fluorescerande kvantitativ PCR är en fuskteknik eller en opålitlig teknik?Nej, det beror på att fluorescerande kvantitativ PCR är känsligare och mer exakt, och en lite felaktig operation ger helt motsatta resultat.En liten förlust är tusen mil bort.Författaren till artikeln kan upprepade gånger torteras av recensenterna.Samtidigt är tidskriftens recensenter också svåra att välja bland olika experimentella resultat.

Allt som allt, vilket pekar på en brist på konsensus i realtids PCR-experiment.För detta ändamål började seniora forskare inom branschen att formulera standarder,kräva att bidragsgivare tillhandahåller nödvändiga experiment- och databearbetningsdetaljer (inklusive nödvändiga data) i artikeln för att uppfylla dessa standarder.

Granskare kan bedöma kvaliteten på experimentet genom att läsa dessa detaljer;framtida läsare kan också använda detta för att upprepa experimentet eller förbättra experimentet.Sedan är de experimentella resultaten som erhålls på detta sätt fulla av information, hög kvalitet och användbara.

MIBBI (Minimum information för biologiska och biomedicinska undersökningar -http://www.mibbi.org) kom till.MIBBI är ett projekt som tillhandahåller standarder för experiment.Den publiceras i naturen.Detta projekt är inriktat på olika biologiska experiment, inklusive cellbiologi, Microarray, qPCR vi ska diskutera nu, etc., och ger varje typ av experiment vid inlämning av manuskript.Den informationen bör alltid tillhandahållas.

I MIBBI-projektet finns två artiklar relaterade till fluorescerande kvantitativ PCR, nämligen:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – en strukturerad språk- och rapporteringsguide för kvantitativa PCR-data i realtid;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiment) – minimiinformation för publicering av artiklar om kvantitativa PCR-experiment i realtid.
Låt oss först prata om RDML, terminologispecifikationen.

Om det inte finns någon standarddefinition för allt är det omöjligt att fortsätta diskussionen, varför termförklaringen är så viktig i tentamen.
Terminologin som används i det fluorescerande kvantitativa PCR-experimentet inkluderar följande innehåll.QIAGEN har gjort den bästa sammanfattningen åt oss.Följande är alla torravaror .

Amplifieringskurva
Amplifieringskurvan hänvisar till kurvan som gjordes under PCR-processen, med cykelnumret som abskissan och fluorescensintensiteten i realtid under reaktionen som ordinatan.

En utmärkt amplifieringskurva bör ha följande egenskaper: baslinjen är platt eller något minskad, och det finns ingen uppenbar uppåtgående trend;kurvans böjningspunkt är klar, och lutningen för den exponentiella fasen är proportionell mot förstärkningseffektiviteten.Ju större lutning, desto högre förstärkningseffektivitet;den övergripande amplifieringskurvan. Parallellen är god, vilket indikerar att amplifieringseffektiviteten för varje rör är likartad;den exponentiella fasen av amplifieringskurvan för prover med låg koncentration är uppenbar.

Baslinje (Baslinje)
Baslinjen är ljudnivån för den tidiga cykeln, vanligtvis mätt mellan den 3:e och 15:e cykeln, eftersom ökningen av fluorescensvärdet orsakad av amplifieringsprodukten inte kan detekteras under denna period.Antalet cykler som används för att beräkna baslinjen kan varieras och kan behöva minskas om höga mallmängder används eller om uttrycksnivån för målgenen är hög.

Att ställa in baslinjen kräver visning av fluorescensdata från linjäritetsförstärkningskurvan.Baslinjen är inställd så att tillväxten av amplifieringskurvan börjar med ett cykeltal som är större än baslinjecykelns toppnummer.Baslinjer måste ställas in individuellt för varje målsekvens.De genomsnittliga fluorescensvärdena detekterade i de tidiga cyklerna måste subtraheras från fluorescensvärdena som erhålls i de amplifierade produkterna.De senaste versionerna av olika Real-Time PCR-programvara tillåter automatisk optimering av baslinjeinställningarna för enskilda prover.

Under de första cyklerna av PCR-amplifieringsreaktionen förändras inte fluorescenssignalen mycket.Att närma sig en rät linje kallas baslinjen, men om vi tittar noga på de första cyklerna ser vi att inom baslinjen är det som händer på bilden nedan.

Bakgrund Bakgrund avser
det ospecifika fluorescensvärdet i reaktionen.Till exempel: ineffektiv fluorescenssläckning;eller ett stort antal dubbelsträngade DNA-mallar på grund av användningen av SYBR Green.Bakgrundskomponenterna i signalen avlägsnas matematiskt av Real-Time PCR-mjukvarualgoritmen.

Reportersignal
Reportersignal hänvisar till den fluorescerande signalen som genereras av SYBR Green eller fluorescensmärkta sekvensspecifika prober under realtids-PCR.

Normaliserad reportersignal (RN)
RN avser fluorescensintensiteten för reporterfärgämnet dividerat med fluorescensintensiteten för det passiva referensfärgämnet uppmätt vid varje cykel.

Passiv referensfärg
I vissa realtids-PCR,det fluorescerande färgämnet ROX används som en intern referens för att normalisera den fluorescerande signalen.Den korrigerar för variationer på grund av felaktig pipettering, brunnsposition och fluorescensfluktuationer på en brunn-för-brunn-basis.

Fluorescenströskeln (tröskel)
justerades över bakgrundsvärdet och signifikant under platåvärdet för amplifieringskurvan.Den måste ligga i det linjära området av amplifieringskurvan, vilket representerar det log-linjära området för PCR-detektion.Tröskelvärden bör ställas in i log-amplifieringskurvan så att den log-linjära fasen av PCR är lätt identifierbar.Om det finns flera målgener i realtids-PCR måste tröskeln ställas in för varje mål .I allmänhet används fluorescenssignalen för de första 15 cyklerna av PCR-reaktionen som fluorescensbakgrundssignalen, och fluorescenströskeln är 10 gånger standardavvikelsen för fluorescenssignalen för de första 3 till 15 cyklerna av PCR, och fluorescenströskeln ställs in i den exponentiella PCR-förstärkningsfasen.I allmänhet har varje instrument sin fluorescenströskel inställd före användning.

Cykeltröskel (CT) eller Crossing Point (CP)
Cykeln vid vilken amplifieringskurvan passerar tröskeln (dvs den punkt vid vilken fluorescensdetektering ökar signifikant).CT kan vara en bråkdel och mängden startmall kan beräknas.CT-värdet representerar antalet cykler som upplevs när den fluorescerande signalen i varje PCR-reaktionsrör når det inställda tröskelvärdet.Det finns ett linjärt samband mellan CT-värdet för varje mall och logaritmen för mallens initiala kopianummer,högre det ursprungliga kopiantalet, desto lägre CT-värdet och vice versa.En standardkurva kan göras genom att använda en standard med känt initialt kopietal, där abskissan representerar CT-värdet, och ordinatan representerar logaritmen för det initiala kopietalet.Så länge som CT-värdet för det okända provet erhålls kan därför provets initiala kopianummer beräknas från standardkurvan.

ΔCT-värde
ΔCT-värde beskriverskillnaden mellan målgenen och motsvarande endogena referensgen CT-värde, såsom en hushållsgen, och används för att normalisera mängden mall som används:
⇒ΔCT = CT (målgen) – CT (endogen referensgen)

ΔΔCT-värde
ΔΔCT-värdet beskriver skillnaden mellan ΔΔCT-medelvärdet för ett prov av intresse (t.ex. stimulerade celler) och medelvärdet för ΔΔCT för ett referensprov (t.ex. ostimulerade celler).Referensprovet kallas även kalibreringsprovet och alla andra prover är normaliserade till detta för relativ kvantifiering:
⇒ΔΔCT = genomsnittlig ΔCT (prov av intresse) – genomsnittlig ΔCT (referensprov)

Endogena referensgener (endogena referensgener)
Uttrycksnivåerna för endogena referensgener, såsom hushållningsgener (hushållningsgener), skiljer sig inte mellan proverna.Genom att jämföra CT-värdena för referensgenen med målgenen kan uttrycksnivån för målgenen normaliseras till mängden ingående RNA eller cDNA (se avsnittet om ΔCT-värden ovan).

Interna referensgener korrigerar förmöjlig RNA-nedbrytning eller närvaro av enzymhämmare i RNA-prover, såväl som variationer i RNA-innehåll, omvänd transkriptionseffektivitet, nukleinsyraåtervinning och provhantering.För att välja den optimala referensgenen (er), modifierade vi algoritmen för att tillåta dess val av den optimala referensen beroende på den experimentella inställningen.

Intern kontroll
En kontrollsekvens som amplifieras i samma reaktion som målsekvensen och undersöks med en annan prob (dvs genom att utföra duplex-PCR).Interna kontroller används ofta för att utesluta misslyckade amplifieringar, till exempel när målsekvensen inte detekteras.
Kalibreringsprov
Ett referensprov (till exempel renat RNA från en cellinje eller vävnad) som används i relativ kvantifiering för att jämföra alla andra prover för att bestämma den relativa expressionsnivån för en gen.Kalibreringsprovet kan vara vilket prov som helst, men är vanligtvis en kontroll (till exempel ett obehandlat prov eller ett prov från tidpunkt noll i experimentet).

Positiva kontroller
använda kontrollreaktioner medkända mängder mall.Positiva kontroller används ofta för att kontrollera att ett primerset eller primer-probe-set fungerar korrekt och att reaktionen är korrekt inställd.

Ingen mallkontroll (NTC)
En kontrollreaktion som innehåller alla nödvändiga komponenter i amplifieringsreaktionen förutom mallen, som vanligtvis ersätts med vatten.Användningen av NTC kan hitta kontamineringen som orsakas av reagenskontamination eller främmande DNA, vilket säkerställer äktheten och tillförlitligheten för detektionsdata.Amplifiering av NTC-kontrollen indikerar kontaminering.

Ingen RT-kontroll (NRT)
RNA-extraktionsprocessen kan innehålla resterande genomiskt DNA, vilket är extremt skadligt och är boven som påverkar datakvaliteten och den naturliga fienden till qPCR, så när man designar experiment måste den utformas för att endast förstärka RNA-detektion.Det finns två sätt, ett är att designa primrar över introner, det andra är att helt ta bort DNA, vilket är bättre, vilket kommer att diskuteras senare.NTR-kontrollen är en magisk spegel för att upptäcka DNA-föroreningar.Om det finns förstärkning betyder det att det finns föroreningar.

Standarder
Standarder är prover med känd koncentration eller kopieantal som används för att konstruera en standardkurva.För att säkerställa standardens stabilitet klonas genfragmentet vanligtvis in i plasmiden och används som standard.

Standardkurvan
späds vanligtvis ut i minst 5 koncentrationsgradienter med standardprodukten enligt fördubblingsförhållandet, och 5 punkter ritas i koordinaterna för CT-värde och kopietal, och punkterna är sammankopplade för att bilda en linje för att generera en standardkurva.För varje standardkurva måste dess giltighet kontrolleras.Lutningsvärdet faller mellan –3,3 och –3,8, och varje koncentration utförs i tre exemplar.Punkter som skiljer sig väsentligt från andra punkter bör kasseras.CT-värdet för provet som ska testas förs in i standardkurvan och uttrycksnivån för provet som ska testas kan beräknas.

CT-värdet för provet som ska testas förs in i standardkurvan och det initiala kopiantalet för provet som ska testas kan beräknas.

Effektivitet och lutning
Lutningen på standardkurvan representerar effektiviteten av realtids-PCR.
·En lutning på -3,322 indikerar att PCR-amplifieringseffektiviteten är 1, eller 100 % effektiv, och mängden PCR-produkt fördubblas vid varje cykel.
·En lutning mindre än –3,322 (t.ex. –3,8) indikerar en PCR-effektivitet
·En lutning större än –3,322 (t.ex. –3,0) indikerar att PCR-effektiviteten verkar vara större än 100 %, vilket är konstigt, hur skulle en PCR-cykel kunna generera mer än dubbelt så mycket av den amplifierade produkten?Denna situation inträffar i den icke-linjära fasen av PCR-reaktionen, det vill säga det finns en stor mängd icke-specifik amplifiering.

smältkurva
Efter att qPCR-amplifieringen är klar värms PCR-produkten.När temperaturen stiger smälter den dubbelsträngade amplifieringsprodukten gradvis, vilket resulterar i en minskning av fluorescensintensiteten.När en viss temperatur (Tm) uppnås kommer ett stort antal produkter att smälta.Fluorescensen sjunker kraftigt.Olika PCR-produkter har olika Tm-värden och olika smälttemperaturer, så att specificiteten för PCR kan identifieras.

Smältkurva (derivatkurva)
Smältkurvan är härledd för att bilda en toppkarta, som mer intuitivt kan visa situationen för PCR-produktfragment.Eftersom smälttemperaturen är Tm-värdet för DNA-fragmentet kan vissa parametrar som påverkar Tm-värdet för DNA-fragmentet bedömas, såsom fragmentstorlek, GC-innehåll, etc. Generellt sett, enligt våra primerdesignprinciper,längden på den förstärkta produkten är i intervallet 80-300 bp, så smälttemperaturen bör vara mellan 80°C och 90°C.

Tolkning av smältkurvan: Om den enda huvudtoppen uppträder mellan 80°C-90°C, betyder det att den fluorescerande kvantitativa PCR är perfekt;om huvudtoppen uppträder mellan 80°C-90°C och diverse toppar uppträder under 80°C, övervägs i princip primerdimeren.Du kan försöka öka glödgningstemperaturen för att lösa det;om huvudtoppen uppträder mellan 80°C-90°C, och den övriga toppen dyker upp igen när temperaturen stiger, anses det i grunden finnas DNA-kontamination, och DNA måste avlägsnas i det inledande skedet av experimentet.

Naturligtvis finns det fortfarande några onormala situationer, som kommer att brytas ner en efter en nedan.
3. Avancerad kunskap

För att göra qPCR måste jag säga MIQE,Minsta informationför publicering avKvantitativRealtids PCRExperiment – ​​den minsta informationen för att publicera artiklar om kvantitativ PCR i realtidexperiment.För att förenkla allas förståelse kommer vi att förenkla huvudinnehållet.

Du kan söka i originaltexten till MIQE på Internet, och det viktigaste är att den angerdatachecklista som måste tillhandahållas vid publicering av en artikel .

Granskare kan bedöma kvaliteten på experimentet genom att läsa dessa detaljer;framtida läsare kan också använda detta för att upprepa eller förbättra experimentet.
Det är värt att notera att i denna lista är vikten av varje lista markerad med E respektive D.Vad betyder det?E: väsentlig information (måste lämnas in).D: önskvärd information (ge så mycket som möjligt).

MIQE (1)—Experimentell design
Många skurkar som har slutfört sitt försvar efter att ha avslutat sina forskarstudier kommer inte att veta hur man utformar ett experiment självständigt, öppnar sina anteckningsböcker och gör vad läraren säger åt dem att göra.Som ett resultat var den experimentella designen inte rigorös, och tidningens redaktion sa att de ville hitta på den här bilden och den bilden, så de gjorde det i en dumhet.Så här är skumparna gjorda!

Närmare hemmet är den första principen för experimentet att bestämmaden experimentella logikens stringens.Det mest grundläggande är den experimentella designen, och det viktigaste med den experimentella designen är hur man ställer in målprovet, referensprovet (kontroll) och antalet repetitioner, så att experimentdata kan refereras, jämföras och övertygande.

Målprovetsyftar på provet som kräver att vi upptäcker målgenen efter en viss behandling.Referensprovetär provet utan någon behandling, vilket ofta kallas vildtyp inom biologin.

Experimentella replikatär mycket viktiga.I allmänhet måste antalet övertygande replikat vara fler än tre.Det är nödvändigt att skilja på vad som är biologisk replikation och vad som är teknisk replikation.

Biologiska replikat: Samma verifieringsexperiment utfört med olika material (tid, växter, partier, reaktionsplattor).

Biologisk dubbelarbete
Låt oss ta bekämpningsmedelsbehandlingen av peppar som ett exempel.Vi vill spraya bekämpningsmedel på de tre växterna av ABC, då är de tre växterna av ABC tre biologiska replikat, och de är samma verifieringsexperiment som utförs med olika material.Men som ett experiment behövs definitivt en kontroll, så vi kan spraya en av grenarna av planta A för att bilda en experimentell grupp av planta A, och inte spraya de andra grenarna av planta A för att bilda en kontrollgrupp.Gör samma sak för B och C.

Tekniska replikat (tekniska replikat): Det är ett upprepat experiment utformat för att undvika fel orsakade av operation, vilket faktiskt är ett duplicerat hål som ingår i samma material.Både behandlingar och kontroller måste ha replikatinställningar (minst tre) av målgenen och den interna referensgenen.

Teknisk upprepning
Ta paprikan som behandlats med bekämpningsmedel som ett exempel igen.För den experimentella gruppen av växt A gjorde vi tre PCR-hål på 1, 2 och 3 för dess målgen respektive interna referensgen, för att ta medelvärdet efter detektionen.För kontroll av anläggning A behandlas även grupper på samma sätt.Gör på samma sätt samma behandling för B- och C-växter.Detta är teknisk upprepning.

Det är värt att noteradet som kommer in i statistiken är den biologiska upprepningen, och den tekniska upprepningen är att testa om det finns några slumpmässiga fenomen i den experimentella processen, för att göra experimentresultaten trovärdiga, det vill säga undvika fel genom att ta deras medelvärde som vi ofta säger.

Negativa kontroller – NTC och NRT
NTC (No-Template Control), en kontroll utan mall, används för att verifiera om det experimentella materialet är kontaminerat.I allmänhet används vatten som mall.Om det finns en fluorescerande reaktion indikerar det att nukleinsyrakontamination har inträffat i laboratoriet.

Dessa föroreningar kommer från: orent vatten, okvalificerade reagenser som innehåller endogent DNA, primerföroreningar, föroreningar av laboratorieutrustning, aerosolföroreningar, etc., måste använda RNase-renare och RNas-hämmare.Aerosolföroreningar är det svåraste att hitta.Föreställ dig att ditt laboratorium är som smog, med olika nukleinsyror suspenderade i luften.

NRT (No-Reverse Transcriptase), kontrollen utan omvänd transkription, är det icke-omvänt transkriberade RNA som en negativ kontroll, vilket är kontrollen av gDNA-resten.

När man gör genuttryck detekteras mängden RNA genom att detektera mängden cDNA efter omvänd transkription.Om det finns gDNA-rester när RNA renas kommer det att orsaka fel i de experimentella resultaten, eftersom de faktiska resultaten som erhålls är gDNA och cDNA.På den aggregerade nivån, inte bara cDNA, måste gDNA avlägsnas helt under RNA-extraktion.

MIQE (2)—exempelinformation
Den så kallade provinformationen innebär att när vi publicerar en artikel om qPCR måste vi förklara provinformationen tydligt, vilket är en oumbärlig del av artikeln.När vi behandlar prover måste vi också reglera vår egen verksamhet för att säkerställa provernas giltighet.

Beskrivningen av provet är bara ett resultat, och vi bör vara mer uppmärksamma på materialen som tagits under hela experimentet.

Val av experimentmaterial
Blodprov – välj färskt blod, högst 4 timmar.Cellprover – välj att samla färska celler under en period av kraftig tillväxt.Djurvävnad—Välj färsk, kraftigt växande vävnad.Växtvävnad – Välj fräsch, ung vävnad.

Du måste ha märkt att det finns ett nyckelord i dessa få meningar: färsk .
För ovanstående prover är det bästa, kostnadseffektiva och stabila kitet på marknaden Foregenes kit, som snabbt och enkelt kan extrahera deras DNA och RNA.

Blood DNA Mini Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

Animal Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA-isoleringskit

Förvaring av experimentmaterial
Generellt sett rekommenderar vi inte att förvara prover, om förhållandena tillåter.Det finns dock många vänner som inte kan genomföra experiment direkt efter provtagning, och vissa behöver till och med bära tankar med flytande kväve till fältet för provtagning.

För den här typen av hårt arbetande vän kan jag bara säga att du inte förstår reagensförbrukningsartiklar.Nu tillverkar många reagensförbrukningsföretag reagens som kan lagra RNA-prover i rumstemperatur, och du kan välja att använda dem.Den konventionella lagringsmetoden är lagring av flytande kväve, med en liten tank för flytande kväve som är lätt att bära.Efter att ha tagit tillbaka provet till laboratoriet, förvara det i ett -80°C kylskåp.

För experiment som involverar RNA måste sexordsprincipen följas:låg temperatur, inga enzymer,ochsnabb .

Begreppet låg temperatur är lätt att förstå;utan enzymer finns RNas överallt i världen vi lever i (annars hade du dödats av HIV), så hur man undviker RNas när man gör experiment är ett mycket viktigt koncept;snabb,Det finns ingen Kung Fu i världen som inte kan brytas, bara hastigheten kan inte brytas.

Därför, på sätt och vis, ju kortare extraktionstid, desto bättre kit.Varför görFöregenes kit betonar hastighet, eftersom de vet det väl.

PS: Vissa tjejer gör experiment väldigt noggrant, men de är inte lika bra som en slam dunk efter flera års arbete.De känner att Gud är orättvis, klagar på andra och söker livet.Faktum är att hon inte förstod det.Han skyddade inte RNA väl, och slam dunk-spelaren var kvick.När han gjorde experimentet trodde han att han skulle avsluta slam dunk med tre gånger, fem gånger och två divisioner, men han gjorde experimentet bra.

Notera: Långsammare, större chanser för RNase-invasion.Hur tränar man sig för att vara snabb?Det finns inget sätt, bara träna mer.

För olika experiment och olika prover är det fortfarande nödvändigt att läsa mer litteratur och välja en lämplig metod för bearbetning.För provinsamlingen och lagringsprocessen kräver MIQE att det måste vara tydligt skrivet i tidningen, så att granskarna kan granska papperets tillförlitlighet, och det är också bekvämt för de chockade ungdomarna att upprepa ditt experiment.

Även om biologiska experiment är svåra, är de avancerade.Om du inte är försiktig kan du störta världen.Till exempel att göra SARS till en biokemisk kris, eller göra hybridris för att rädda 1,3 miljarder människor.Bilden nedan är ett kemiskt experiment, du borde förstå hur stolt du är över din forskning bara genom att titta på hans kukliknande utseende.Glöm det, svärta honom inte.

MIQE (3) – nukleinsyraextraktion.
Nukleinsyraextraktion är en stor händelse, och alla molekylärbiologiska experiment börjar med nukleinsyraextraktion.Först och främst, låt oss kopiera MIQEs innehåll om nukleinsyraextraktion.

Om du tittar på den här formen kan du inte stanna på ytan.Formen är en dogm.För att vara en toppstudent måste du fråga varför.Det väsentliga innehållet i denna tabell är: Fortsättrenheten, integriteten, konsistensen och extraktionsmängden av RNA .

Den första delen avprocess eller instrument är nukleinsyraextraktionssteget.Om du använder en automatisk nukleinsyraextraktor för att extrahera (avancerat, kontakta mig för köp), måste du ange modellnamnet på instrumentet.

Namnet på satsen och

vilket kit som användes för ändringsdetaljerna, vilka speciella reagenser som tillsattes eller vilka speciella operationer som gjordes bör förklaras tydligt så att andra enkelt kan upprepa ditt experiment.

Vissa människor lägger till några speciella reagenser när de extraherar speciella prover, och tänker att detta är deras hemliga vapen och berättar inte för andra.Samtidigt som de håller det hemligt, förlorar de också möjligheten att få din artikel att glänsa.Var inte smart, du måste vara ärligare än landets gamla Zhang i vetenskaplig forskning, om du vill vara smart kommer artikeln att göra dig dum.

måste komma ihåg produktnumret på satsennär du beställer satsen och skriver artikeln.Det finns i allmänhet två nummer på satsen: Katt-katalognummer (produktnummer, artikelnummer), Lot-produktpartinummer (Används för att indikera vilken batch produkten kom ifrån).

Dessutom används ofta CAS-numret vid beställning av biokemiska reagens, och jag kommer att popularisera det tillsammans.CAS-numret är det nummer som American Chemical Society ger varje nytt kemiskt läkemedel.Vanligtvis är tre siffror sammankopplade med ett bindestreck.Rushuis CAS-nummer: 7732-18-5.Kemikalier har ofta flera alias, men CAS-numret är unikt.Vid beställning av läkemedel kan du först kontrollera dess CAS-nummer.

Närmare hemmet, varför måste vi beskriva dessa saker tydligt?Det är faktiskt också för att kontrollera kvaliteten på RNA-extraktion.Användningen av instrument och kit kommer att göra RNA-extraktionen mer konsekvent.Extraktionsskalan i vanliga laboratorier är inte stor, och den kan erhållas med kit.

Detaljerna för DNas- eller RNase-behandling
Den viktiga frågan med fluorescerande kvantitativ PCR är att förhindra DNA-kontamination, och experimentera inte om det finns kontaminering.Därför är det absolut nödvändigt att ange processen du använde för att bearbeta DNA:t, för att visa att DNA:t i den experimentella processen har tagits bort helt och fullständigt.representeras av ett schematiskt diagram.

Schematiskt diagram av RNA och DNA
I allmänhet är metoden för att ta bort DNA att behandla RNA med DNas efter extraktion.Det är dock relativt gamla metoder.Kommersiella RNA-extraktionssatser har kunnat ta bort DNA under extraktionsprocessen utan att tillsätta DNas.Till exempel en serie kit från Foregene .

Notera: Att ta bort DNA under RNA-extraktion är ett mycket farligt tveeggat svärd, som förlänger operationstiden för RNA-extraktion och ökar risken för RNA-nedbrytning.I grund och botten är det en avvägning mellan RNA-utbyte och renhet.

Dessutom är mängden DNas som tillsätts till den kiseldioxidbaserade adsorptionskolonnen mycket liten, och högkvalitativt DNas måste användas för att uppnå effekten.Ooptimerat DNas kan inte smältas snabbt och fullständigt.Detta är ett test av handlarens tekniska nivå.Naturligtvis finns det ännu fler konstiga handlare som skryter med att DNA kan tas bort utan DNas.Man kan säga att alla som skryter om att DNA kan tas bort helt utan DNas är en huligan.DNA är en relativt stabil dubbelsträngad struktur, och den kan inte utplånas bara genom att prata och skratta.

Föroreningsbedömning
bedömningsmetod: elektroforesdetektion, 1% agaros, 6V/cm, 15min, laddning 1-3 ul

Nukleinsyra kvantitativ analys
mäts vanligtvis med en UV-spektrofotometer.Låt mig först popularisera innebörden av de tre värdena för OD260, OD280 och OD230.
·OD260nm: Det är absorptionsvåglängden för den högsta absorptionstoppen för nukleinsyra, och det bäst uppmätta värdet sträcker sig från 0,1 till 1,0.Om inte, späd eller koncentrera provet för att få det inom intervallet.
·OD280nm: Det är absorptionsvåglängden för den högsta absorptionstoppen för protein och fenoliska ämnen.
·OD230nm: Det är absorptionsvåglängden för den högsta absorptionstoppen för kolhydrater.

Låt oss sedan prata om varje indikators roll.För A260 kan den användas för att mäta utbytet av nukleinsyra.När OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

För renhet måste vi titta på de förhållanden som vi vanligtvis ser: OD260/280 och OD260/230.
·Rent DNA: OD260/280 är ungefär lika med 1,8.När det är större än 1,9 indikerar det att det finns RNA-föroreningar, och när det är mindre än 1,6 indikerar det att det finns protein- och fenolföroreningar.
·Rent RNA: 1,7
·OD260/230: Oavsett om det är DNA eller RNA är referensvärdet 2,5.När det är mindre än 2,0 indikerar det att det finns föroreningar av socker, salt och organiskt material.

RNA-integritet

Det är mycket viktigt att mäta integriteten av RNA.I allmänhet är det nödvändigt att göra ett RNA-denatureringsgelexperiment för att kontrollera om ljusstyrkan mellan 28S och 18S RNA är ett dubbelt förhållande.När det tredje bandet 5S dyker upp betyder det att RNA:t har börjat brytas ned, förutom för ryggradslösa djur.

Data för RNA-kvalitetsbedömning: Utöver ovanstående tester finns det även några mer avancerade instrumenttester vad gäller RNA-integritet, såsom RQI-integritetstestet av Experions automatiska elektroforessystem, som kan detektera om RNA bryts ned osynligt.

I vetenskaplig forskning är fluorescerande kvantitativ PCR en jämförelse mellan målgenen och den interna referensgenen.Därför, i processen för bevarande av RNA-prov, RNA-extraktion, etc., är det primära målet att säkerställa RNA:s integritet.

Hur integriteten hos RNA påverkar balansen mellan målgenen och den interna referensgenen kan enkelt förstås från figuren nedan.Nedbrytning kommer att leda till ofullständighet i genen, oavsett om det är ofullständighet hos den interna referensgenen eller ofullständighet hos målgenen, kommer det att ha stor inverkan på data.

Schematiskt diagram av målgenen och referensgenen, får inte vara sant

Hämningstest (om CT-värdet är undertryckt under hög eller låg koncentration eller andra förhållanden)

Med denna figur som ett exempel är Ct-värdena för de fem kurvorna som följer.Fördelningen av CT-värden mellan kurvorna är ojämn och Ct-värdena är försenade under höga och låga koncentrationer, vilket är fallet med PCR-hämning.

Nyckelpunkt: I processen med RNA-extraktion måste vi överge missuppfattningar och fastställa korrekta.

Den felaktiga idén är: RNA-extraktion eftersträvar bara utbytet, och tänker att ju större mängd RNA som erhålls, desto bättre.Faktum är att när vi gör kvantifiering, om antalet gener inte är särskilt stort, behöver vi inte mycket RNA.Mängden RNA du extraherar är mer än tillräckligt.

Det korrekta konceptet är:RNA-extraktion bör eftersträva renhet, integritet och konsistens.Renhet kan säkerställa att den efterföljande omvända transkriptionen inte hämmas och att data inte kommer att påverkas av DNA.Integritet säkerställer balansen mellan målsekvenser och interna referenser.Konsistens säkerställer stabil provladdning.

MIQE (4) – omvänd transkription
Missuppfattning: strävan efter högre provvolym.
Rätt koncept: Sträva efter konsistens (stabilitet), oavsett mängden RNA som laddas, förblir effektiviteten av omvänd transkription konsekvent, vilket säkerställer att skillnader i cDNA verkligen kan återspegla skillnader i mRNA.
Vi förklarar denna process med ett schematiskt diagram:

Schematiskt diagram av omvänd transkriptionseffektivitet, stämmer inte
Först och främst måste vi förstå skillnaden mellan omvänd transkriptionsprocessen och PCR-processen.PCR genomgår flera uppvärmnings- och hybridiseringsprocesser, och målfragmentet växer exponentiellt;medan omvänd transkription inte har denna process, kan vi föreställa oss att omvänd transkription faktiskt är en-till-en Under replikeringsprocessen, lika många bitar av RNA

eftersom det finns kan få så många bitar av cDNA-information, bör det förstås vid det här laget, eftersom fragment stora och små har omvänt transkriberats, och det är omöjligt att fokusera på ett fragment.Och eftersom mängden RNA är relativt liten är mängden cDNA som erhålls också relativt liten, till skillnad från PCR, som har en amplifieringseffekt, så det är i princip omöjligt att upptäcka.

cDNA-elektroforesresultat
För det andra, idealiskt, utförs omvänd transkription en-till-en, men inget omvänt transkriptas från något företag kan uppnå denna effekt.I grund och botten vandrar effektiviteten för de flesta omvända transkriptaser mellan 30-50%.Om så är fallet skulle vi hellre ha en relativt stabil omvänd transkriptionseffektivitet, vilket är vad vi vill se i figuren: 3 RNA får 2 cDNA, 6 RNA får 4 cDNA, så oavsett hur mycket prov som laddas är effektiviteten för omvänd transkription relativt stabil.Vi vill inte se situationen där omvänd transkriptionseffektivitet är instabil och hög koncentration hämmas.

Så, hur kan man verifiera om den omvända transkriptionseffektiviteten är stabil?Metoden är mycket enkel, du behöver bara göra ett jämförelsetest: det ena är att omvänd transkribera till cDNA efter fördubblad utspädning av RNA, och den andra är att göra fördubbling utspädning efter omvänd transkribering till cDNA, och sedan göra qPCR för att se den erhållna lutningen Är det konsekvent.Som toppstudent bör du förstå det på några sekunder.Enligt nedanstående:

Spädning av RNA och cDNA för att testa om effektiviteten av omvänd transkription är stabil
Omvänt transkriptas och kit
Hur kan perfekt fluorescerande kvantitativ PCR ha utmärkt omvänt transkriptas och kit.Omvänt transkriptas delas grovt in i två typer enligt källan, AMV ellerM-MLV, och deras prestanda är densamma som visas i tabellen.

RNase H-aktivitet
RNase H är ribonukleas H, det kinesiska namnet är ribonukleas H, vilket är ett endoribonukleas som specifikt kan hydrolysera RNA i DNA-RNA-hybridkedjan.RNas H kan inte hydrolysera fosfodiesterbindningarna i enkelsträngat eller dubbelsträngat DNA eller RNA, det vill säga det kan inte smälta enkelsträngat eller dubbelsträngat DNA eller RNA.Används vanligen vid syntesen av den andra strängen av cDNA.

Det är en konstig sak.Vi säger att omvänt transkriptas har RNas H-aktivitet, inte att omvänt transkriptas innehåller RNas H, och det kanske inte är möjligt att separera RNas H från omvänt transkriptas, kanske på grund av konformationen av vissa grupper i omvänt transkriptas. Denna aktivitet orsakas av det omvända transkriptaset.

Därför, oavsett den högre omvänd transkriptionseffektiviteten hos AMV, minskar dess RNas H-aktivitet utbytet av cDNA.Naturligtvis optimerar reagenstillverkare ständigt sina produkter för att eliminera RNase H-aktivitet i omvänt transkriptas så mycket som möjligt för att öka utbytet av cDNA.
Glödgningstemperatur

Sekundär struktur av RNA vid olika temperaturer
Se figuren ovan för den sekundära strukturen av RNA vid olika temperaturer och använd onlineverktyget mFold för att bestämma den sekundära strukturen för målfragmentet under specifika temperatur- och saltkoncentrationsförhållanden.Vid 55°C är RNA:ts sekundära struktur fortfarande mycket komplex, omvänt transkriptas kan inte fungera och den sekundära strukturen kan inte lösas helt förrän 65°C, medan den optimala temperaturen för AMV och M-MLV är mycket lägre än denna temperatur.
vad ska man göra?Den sekundära strukturen är den komplementära parningen av själva mallen, vilket leder till stark konkurrens mellan primern och omvänt transkriptas och mallen, vilket resulterar i en serie problem såsom låg E och dålig repeterbarhet.

vad ska man göra?Öka bara glödgningstemperaturen så mycket som möjligt.

Många reagenstillverkare förbättrar sitt omvända transkriptas genom genteknik.Vissa ökar reaktionstemperaturen, såsom Jifan och Aidelai, och vissa tar bort den aktiva gruppen av RNase H-enzymet för att förbättra affiniteten mellan enzymet och RNA-mallen.Hög affinitet kan konkurrenskraftigt pressa ut den sekundära strukturen och läsa igenom smidigt, och även avsevärt förbättra effektiviteten av omvänd transkription.
Nyckelpunkt: Omvänd transkription är viktigare för att eftersträva konsistensen av omvänd transkriptionseffektivitet (enzymer måste inte bara vara effektiva utan också stabila), snarare än mängden prov som laddas, om det inte är en särskilt storskalig fluorescerande kvantitativ PCR kommer det inte att vara möjligt alls.Flera cDNA.
Olika tillverkare har också gjort vissa ansträngningar i strävan efter konsekvens.Till exempel har de flesta företag nu paketerat omvänd transkription som ett standardpaket för försäljning, vilket är ett bra val.
Till exempel Foregenes RT Easy Series-kit:

RT Easy I (Master premix för första sträng cDNA syntes kit)

MIQE (5) – målgeninformation

Ovanstående figur förklarar
1. Huruvida denna gen är effektiv för upprepade experiment kan i allmänhet verifieras genom upprepade experiment.
2. Gen-ID, du vet.
3. Genlängd, målgenens totala längd är definitivt inga problem.När du designar primers, se till att längden på amplikonet är mellan 80-200 bp för att säkerställa en bättre amplifieringseffektivitet.
4. Sekvens Blast jämförelseinformation, målgenen måste jämföras i genbank för att förhindra ospecifik amplifiering.
5. Förekomst av pseudogener.En pseudogen är en DNA-sekvens som liknar en normal gen men förlorar sin normala funktion.Det finns ofta i multi-genfamiljen av eukaryoter.Det representeras vanligtvis av ψ.Det är en icke-funktionell genomisk DNA-kopia i genomet som är mycket lik den kodande gensekvensen., är i allmänhet inte transkriberade och har ingen tydlig fysiologisk betydelse.
6. Placering av primrar i förhållande till exoner och introner.Under de första åren, när vi löste problemet med DNA-kontamination, ägnade vi ofta uppmärksamhet åt positionerna för primrar, exoner och introner, och övervägde allmänt att designa primrar över introner för att undvika DNA-amplifiering.Se figuren nedan: svart representerar introner, olika blåa färger representerar exoner, rosa representerar vanliga primers och ljusrött representerar intronspännande primers.

Schematisk, aldrig sant
Vilken perfekt plan detta verkar, men i de flesta fall är trans-intronprimrarna inte så magiska som föreställt sig, och de kommer också att orsaka ospecifik amplifiering.Så det bästa sättet att förhindra DNA-kontamination är att ta bort DNA helt.
7. Konformationsförutsägelse.Använd det här exemplet igen, använd onlineverktyget mFold för att bestämma den sekundära strukturen för målfragmentet vid en specifik temperatur och saltkoncentration.

Sekundär struktur av RNA vid olika temperaturer
Den sekundära strukturen är den komplementära parningen av själva mallen, vilket kommer att leda till stark konkurrens mellan primer- och mallparningen, och chanserna för primerbindning är mindre, vilket resulterar i en rad problem som låg E och dålig repeterbarhet.Genom programvaruförutsägelse, om det inte finns något sekundärt strukturproblem, skulle det vara bra.Om det finns kommer vår uppföljande artikel specifikt att diskutera hur man löser det här problemet.

MIQE (6)—qPCR-oligonukleotider

För fluorescerande kvantitativ PCR är det första du kämpar med varje dag RNA-extraktion, och det andra kan vara primerdesign.
Först och främst kontrollerar vi fortfarande reglerna om primerdesign enligt MIQE-checklistan.Det är så enkelt att skurkarna kan skratta, och vi kan avsluta det i en mening: ta reda på sekvensen och positionen för primerproben och modifieringsmetoden.För primerreningsmetoden är primersyntes så billig för närvarande, qPCR är värd PAGE och ovan reningsmetoder, och informationen om syntesinstrumentet är inte viktig.Många människor har gjort primers i decennier och vet inte att synthesizern är ABI3900.
När det gäller principerna för primerdesign, behöver du inte memorera dem utantill, eftersom de flesta primerdesignprogramvara eller onlineverktyg kan ta hand om dessa problem (rekommenderat onlineverktyg primer3.ut.ee/), och 99,999% av primerdesign görs inte manuellt Titta, författaren designar ibland hundratals primers per dag, om du läser det en efter en.
Kontrollera bara följande punkter efter att primers har designats:
1. Designprimrar nära 3'-änden: I fallet med användning av oligo dT-primrar för cDNA-första-strängssyntes, med tanke på effektiviteten av omvänd transkription och RNA-integritet, måste de designade primrarna designas nära 3'-änden för att förbättra amplifieringseffektiviteten.Använd en bild för att förklara enligt följande (det finns inget sätt att förstå detta):

Varför ska primers designas nära 3′-änden, det får inte vara sant
2. TM-värde: Tm-värdet är vid 55-65°C (eftersom exonukleasaktiviteten är högst vid 60°C), och GC-halten är vid 40%-60%.
3. BLAST: För att undvika ospecifik amplifiering av genomet måste Blast användas för kompletterande verifiering.

MIQE(7)—qPCR-process

1. qPCR-kit
Enligt kraven i MIQE måste vi tydligt beskriva de fullständiga reaktionsförhållandena i artikeln, inklusive konfigurationen av PCR-reaktionssystemet, vilket kit som används, vem är tillverkaren, hur stort är reaktionssystemet, om färgmetoden eller sondmetoden används, PCR-programinställningar.Veteranförare kommer definitivt att upptäcka att så länge som satsen är vald, bestäms ovanstående information i princip.
För närvarande är tillverkning och produktion av fluorescerande kvantitativa PCR-kit en mycket mogen teknologi.Så länge du inte väljer extremt dåliga tillverkare är sannolikheten för problem inte stor, men vi vill ändå dela med oss ​​av några punkter:
Hotstart Taq-enzym:Den viktigaste delen av PCR är det hetstartade Taq-enzymet.Hot-start enzymerna på marknaden är generellt uppdelade i två typer, den ena är ett kemiskt modifierad hot-start enzym (man kan föreställa sig det som paraffininbäddning), och den andra är är ett hot-start enzym för antikroppsmodifiering (antigen-antikroppsbindning).Kemisk modifiering är ett tidigt sätt att varmstarta enzymer.När en viss temperatur uppnås kommer enzymet att frigöra sin aktivitet.Det antikroppsmodifierade varmstartsenzymet använder biologiska metoder för att blockera enzymets aktivitet.När en viss temperatur uppnås kommer antikroppen att denatureras och inaktiveras som ett protein, och enzymaktiviteten kommer att aktiveras.

Men vad är nyttan med detta?Så är fallet, frisättningsaktiviteten hos antikroppsmodifierade enzymer är snabbare än hos kemiskt modifierade enzymer, så vad gäller känslighet har antikroppsmodifierade enzymer en liten fördel, så att det i princip inte finns några kemiskt modifierade enzymer i kiten på marknaden.Om det finns, så har denna tillverkares teknik fortfarande fastnat i millenniets era.
Magnesiumjonkoncentration:Magnesiumjonkoncentrationen är mycket viktig i PCR-reaktionen.Lämplig magnesiumjonkoncentration kan främja frisättningen av Taq-enzymaktivitet.Om koncentrationen är för låg kommer enzymaktiviteten att reduceras avsevärt;om koncentrationen är för hög kommer den enzymkatalyserade icke-specifika amplifieringen att förstärkas.Koncentrationen av magnesiumjoner kommer också att påverka hybridiseringen av primrar, smälttemperaturen för mallen och PCR-produkter, och därigenom påverka utbytet av amplifierade fragment.Koncentrationen av magnesiumjoner kontrolleras i allmänhet till 25 mM.Naturligtvis, för ett bra kit måste koncentrationen av magnesiumjoner kontrolleras väl.Vissa handlare lägger till ett magnesiumjonkelatmedel till reagenset, vilket kan uppnå effekten av automatisk justering av magnesiumjonkoncentrationen.
Fluorescerande färgämneskoncentration:Fluorescerande färgämne, som är det SYBR Green vi vanligtvis använder, genererar huvudsakligen fluorescens genom att binda till det mindre spåret av dubbelsträngat DNA, eftersom bindningen av färgämnet till dubbelsträngat DNA är ospecifik, det vill säga så länge som dubbelsträngat DNA kombineras med det, kan fluorescens uppstå, så primer-mallar och bakgrundsdimerer kommer att kombineras med det i systemet.
PS: På grund av dess ljuskänsliga egenskaper är produkter på marknaden i allmänhet förpackade i bruna ogenomskinliga centrifugrör (som visas på bilden nedan).Detta kommer dock att stöta på ett problem.Det är svårt att se om vätskan sugs vid provtagning.I detta avseende är Qingke verkligen den mest användarvänliga (som visas på bilden nedan), och det genomskinliga röret är förpackat i en ogenomskinlig plåtpåse.Lägg den sedan i en plåtpåse, med hänsyn till bekvämligheten med att undvika ljus och provtagning.Du måste välja rätt produktnummer.TSE204 är en superkostnadseffektiv tillvaro, vilket gör att jag vill plantera gräs.

Koncentrationen av det fluorescerande färgämnet är också mycket viktigt.Om koncentrationen är för låg kommer amplifieringskurvan inte att gå upp i det senare skedet och är inte perfekt;om koncentrationen är för hög kommer det att orsaka brusstörningar.Eftersom den fluorescerande kvantitativa PCR huvudsakligen beror på CT-värdet, om koncentrationen av det fluorescerande färgämnet inte justeras ordentligt, är den låga punkten bättre än den högsta.Naturligtvis är lämplig färgämneskoncentration bäst.

ROX: ROX-färgämnen används för att korrigera för fluorescenssignalfel från brunn till brunn.Vissa instrumenttillverkare kräver kalibrering, medan andra inte gör det.Till exempel kräver användningen av Thermo Fisher Scientifics realtids-PCR-förstärkningsinstrument vanligtvis kalibrering, inklusive 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc. De allmänna instruktionerna i kitet kommer att beskriva det.
Foregenes qPCR Mix innehåller även ROX-färgämne, vilket är bekvämt att använda i olika modeller.

Realtids PCR Kit-Taqman

Svag vätebindningsbehandling: Behandlingen av svaga vätebindningar är en relativt teknisk fråga.Ingenting har läst manualerna för många kit, men ingen av dem nämnde detta ämne.Det är faktiskt så viktigt.Kombinationen av baser beror huvudsakligen på styrkan hos vätebindningar.Starka vätebindningar är normal amplifiering, och svaga vätebindningar leder till ospecifik amplifiering.Om svaga vätebindningar inte kan elimineras väl, kan icke-specifik amplifiering undvikas.Inom författarens ram har endast ett fåtal företag märkt detta problem.När du köper kitet kan du hänvisa till om du har funderat på en lösning i detta avseende för det kit du vill välja.

Reaktionsvolym: 20-50ul-systemet används oftare, och mindre volymer kommer sannolikt att orsaka fel.Generellt sett kommer instruktionerna i kitet att rekommendera användning av PCR-reaktionsvolymer.Var inte smart och använd mindre volymer för att spara kostnader.målet för.Den volym som rekommenderas av handlarna har faktiskt testats, och det kan vara så att de inte kan lösa problemet med fel orsakade av små volymer.
2. Tillverkare och artikelnummer för rörplattan
Alla känner till principen för fluorescerande kvantitativ PCR.Fluorescensuppsamling utförs huvudsakligen genom PCR-rörlock.När du väljer PCR-förbrukningsmaterial, var uppmärksam på två punkter: bra ljusgenomsläpplighet och lämplig för instrumentet.Generellt sett är brädorna och rören för vanliga märken bra, men du måste välja noggrant när det gäller anpassning, annars kommer du inte att kunna använda instrumentet.

4. Kunskap på högsta nivå

MIQE (8)—qPCR-validering
Detta är högsta prioritet för qPCR!Så många hjältar har fallit i sanden här.Naturligtvis är det också möjligt att du har tur och generna du studerat är enkla, så du flöt genom isgrottan längs vinden.Verifieringsinformationen för qPCR är avsedd att testa uppgifternas tillförlitlighet.Vi listar nödvändig verifieringsinformation enligt följande:

1.Specificitetstest
Specificiteten för målgenamplifiering testas genom att kontrollera om elektroforesbilden är ett enda band;sekvensverifiering;smältkurva för att se om toppkartan är enkel;verifiering av enzymspjälkning och andra metoder.
Här fokuserar vi på tanalys av icke-specifik amplifiering med metoden för smältkurvor.Generellt sett, när vi designar primers, krävs att storleken på produktfragmentet ligger i intervallet 80-200 bp, vilket gör att smälttemperaturen för PCR-produkten är 80-85 °C.Därför, om det finns diverse toppar, måste det finnas andra icke-specifika amplifieringsprodukter;om toppen uppträder under 80°C anses den i allmänhet vara en primerdimer;om toppen visar sig över 85°C anses det i allmänhet vara DNA-kontamination eller mer ospecifik amplifiering av stora fragment.
Notera: Ibland finns det bara en enda topp vid 80°C.För närvarande måste detta koncept följas.Det är troligt att amplifieringsresultaten alla är primerdimerer.

Normal smältkurva (enkel topp utan ospecifik amplifiering)

Problematisk smältkurva (ospecifik förstärkning av falska toppar)
【Fallanalys】

Det finns en huvudtopp, men primerdimeren är allvarlig
Entoppssmältkurvan i figuren nedan kan lätt lura dina ögon och tro att det är ett perfekt experiment, men resultatet är helt fel.Vid denna tidpunkt måste vi titta på smälttemperaturen.Topptemperaturen är under 80°C, vilket är helt primer-dimer.

Inget målfragment, alla primerdimerer
Här kan min bror inte sluta.Bilden nedan är en bild tagen med en mobiltelefon skickad till mig av en skurk.Reagenserna han använde är alla vanliga märken i branschen.Han bytte från ett T-prefix-märke till ett annat T-prefix-märke.Jag tror att du redan har gissat det.Skräpet ropade till mig: "Reagenset som användes på den första bilden är för bra, och toppen är singel.Senare, efter att ha använt reagenset du rekommenderade, blir det som den andra bilden, med blandade toppar.Du har gjort mig olycklig."
Separera de två graferna.Vid första anblicken har den ena en enkel topp och den andra har en dubbel topp.Strunt, en enda topp är såklart bra.Är det sant?
Värre än Dou E, om jag lägger de två bilderna på bilden nedan så förstår ni direkt.Faktum är att vi lätt blir förlamade av den här typen av bilder.Efter noggrann analys fann vi att: toppen av den första figuren är vid 75°C, vilket är fullständigt primerdimer;toppen av den andra figuren visas vid 75°C och 82°C, åtminstone finns det Produkten visas.

Bilder på feedback från elever
Så det grundläggande problemet är inte problemet med reagens, utan problemet med primerdesign.Samtidigt bevisar det också att vissa stora märken inte är av järnkvalitet, och det bevisar också vad min bror sa tidigare: Det är inte reagensmärket som stödjer din artikel.Det är din artikel som stödde varumärket av reagenser.Föreställ dig bara, om skurken inte ändrade reagenserna skulle fel data skickas till journalen, och det som skulle hända skulle vara en tragedi.
2. Ct-värde för blankkontroll
Förklara inte, om blankkontrollen har ett Ct-värde, är det inte föroreningar?Du måste dock fortfarande förstå vilken blank kontroll som har ett Ct-värde.Om det är NTC betyder det att det finns främmande DNA såsom reagenskontamination.Om det är NRT betyder det att det extraherade RNA:t har DNA-kontamination.
3. Standardkurva
Inklusive lutning och beräkningsformel kan PCR-effektiviteten beräknas genom formeln.Ett perfekt experiment kräver att lutningen på standardkurvan närmar sig 3,32 och att R² närmar sig 0,9999.
4. Linjärt dynamiskt område
Det dynamiska området för reaktionen är linjärt.Enligt mallen som används för att generera standardkurvan, bör det dynamiska området inkludera minst 5 koncentrationsgradienter och vara uppmärksam på förändringen av Ct-värden vid höga koncentrationsgradienter och låga koncentrationsgradienter.
5. Detektionsnoggrannhet
Förändringar i qPCR-resultat, det vill säga dålig repeterbarhet, det vill säga dålig precision, orsakas av många faktorer, inklusive temperatur, koncentration och drift.qPCR-precisionen blir i allmänhet mindre kontrollerbar när antalet kopior minskar.Helst inom experimentell variation bör denna tekniska variation vara skild från biologisk variation, och biologiska replikat kan direkt adressera statistiska skillnader i qPCR-resultat mellan grupper eller behandlingar.Särskilt för diagnostiska analyser måste den bästa inter-assayprecisionen (repeterbarhet) över platser och operatörer rapporteras.
6. Detektionseffektivitet och LOD (i multiplex qPCR)
LOD är den lägsta koncentrationen av 95 % av positiva prover som detekterats.Med andra ord bör koncentrationen av LOD som finns i en uppsättning målgenreplikat inte överstiga 5 % av de misslyckade reaktionerna.När du gör multiplex qPCR-analys, särskilt för samtidig detektering av punktmutationer eller polymorfismer, måste multiplex qPCR ge bevis för att noggrannheten hos flera målfragment inte äventyras i samma rör, multipeldetektion och enkelrörsdetektion Effektivitet och LOD ska vara desamma.Speciellt när högkoncentrationsmålgener och lågkoncentrationsmålgener amplifieras samtidigt, måste detta problem uppmärksammas.
Problem och lösningarGenerellt sett fokuserar de problem som ofta uppstår vid qPCR-felsökning på följande aspekter:
ospecifik amplifiering
·Svårt val av primerkoncentration och problem med primer-dimerer
·Glödgningstemperaturen är felaktig
·Sekundär struktur påverkar förstärkningseffektiviteten
ospecifik amplifiering
ospecifik amplifieringinträffar, övervägs det generellt om primerdesignen inte är lämplig, men om du inte har bråttom att byta primers kan du prova följande metoder först (principen är också bifogad):
·Öka glödgningstemperaturen – försök att göra svaga vätebindningar oförmögna att upprätthålla;
· Förkorta glödgnings- och töjningstiden – minska risken för svaga vätebindningar;
· Minska primerkoncentrationen – minska risken för bindning av redundanta primers och icke-målområden;
Låg förstärkningseffektivitet
Den motsatta situationen till icke-specifik amplifiering – låg amplifieringseffektivitet och åtgärderna för att hantera låg amplifieringseffektivitet är precis den motsatta:
· Förläng glödgnings- och töjningstiden;
·Ändra till trestegs PCR och minska glödgningstemperaturen;
·Öka primerkoncentrationen;
Ps: Många doktorander födda på 90-talet är ovilliga att studera hur man felsöker experiment, och hoppas att satsen helt kan lösa problemet (om du vill gå till ett reagensföretag för att göra forskning och utveckling efter examen), i själva verket tänker reagenstillverkarna också så här, jag hoppas att det är en idiot. Det kan användas när du får det, så reagenstillverkare har lagt ner en hel del problem med introduktion, inklusive introduktion. absorptionsfaktorer.För att enkelt lösa problemet måste dårar fortfarande läsa introduktionen av reagensföretaget för att se om det finns en faktor som absorberar svaga vätebindningar.
Svårt val av primerkoncentration och problem med primer-dimerer
Metod 1: Generellt sett har kitinstruktionerna för qPCR rekommenderade system och rekommenderade primerkoncentrationer.
Metod 2: Felsökning genom att ställa in primerkoncentrationsgradienten.Bilden nedan är stulen från ett företag för att illustrera.Figuren nedan visar de kvantitativa fluorescensresultaten gjorda med tre primerkoncentrationsgradienter (100 nM, 250 nM, 500 nM) och fyra mallkoncentrationsgradienter (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Ct-värdet för experimentresultaten plottas enligt följande:

Val av primerkoncentration Sammanfoga varje primerkoncentration till en linje enligt följande:

Valet av primerkoncentration är uppenbart, det linjära förhållandet mellan primerkoncentrationen på 100 nM och 250 nM är bättre, och det linjära förhållandet för primerkoncentrationen på 500 nM är relativt dåligt.I 100nM och 250nM är Ct-värdet på 250nM relativt litet, så den optimala primerkoncentrationen är 250nM.Allmänt sett kan allvarliga primer-dimerer ses i smältkurvan.Vad händer om de designade primrarna inte kan undvika primer-dimerer?
Metod 3: Minska mängden primers och öka glödgningstemperaturen (du behöver inte förklara).
Det empiriska värdet för glödgningstemperaturen är 60°C.Om du inte är säker, hur väljer man en lämpligare glödgningstemperatur?Svaret är detsamma som valet av primerkoncentration –gradienttest.Ta en bild från företaget Bio-rad för att illustrera problemet.För amplifiering av ett visst målfragment, ställ in åtta temperaturgradienter, var och en med tre repetitioner, och den erhållna amplifieringskurvan är som följer:

val av glödgningstemperatur:
·70°C, 69°C—I grund och botten kan primrarna inte kombineras, så det finns ingen amplifiering.
·67,3°C – Det finns en liten mängd förstärkning i början, och Ct-värdet är relativt stort.
·64,5°C——Ct-värdet minskar.
· Vid 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C och 55,0°C tenderade Ct-värdena i princip att vara stabila, men de slutliga fluorescensvärdena var olika.
Hur väljer man?Princip: Den första principen är det högre Ct-värdet.För samma Ct-värde, välj en högre glödgningstemperatur för att undvika dimerisering och ospecifik amplifiering.Även om det finns ett högre fluorescensvärde vid 55°C kan det finnas dimerer eller icke-specifik amplifiering i den.
Men om du är lika smart som du kommer du definitivt att tänka: Logiskt sett, om PCR-reaktionen är väldigt specifik, så länge primerkoncentrationen överstiger minimikravet, bör de höga och låga punkterna inte ha någon effekt, precis som fluorescerande färgämnen och dNTP.Så länge som glödgningstemperaturen är optimerad på rätt sätt, kommer effekten av primerkoncentrationen på Ct-värdet naturligtvis att minimeras.

Glödgningstemperaturen är optimerad på rätt sätt, och effekten av primerkoncentrationen på CT kommer att minimeras
Sekundär struktur påverkar förstärkningseffektiviteten
Låt oss ta bilden från Bio-rad för att illustrera problemet.Den designar också en temperaturgradient för att amplifiera en gen med en sekundär struktur.

Sekundär struktur uppstår
Det kan ses att när temperaturgradienten minskar börjar produkter att dyka upp och Ct-värdet går framåt och når minimivärdet vid 60,7°C, och när temperaturgradienten minskar blir Ct-värdet större.Omvänt, när temperaturen ökar, öppnas den sekundära strukturen och förstärkningseffektiviteten ökar.Efter att ha uppnått en viss temperatur kan en ökning av temperaturen inte förbättra förstärkningseffektiviteten.Eftersom primrarna inte kan kombineras stabilt vid denna tidpunkt.Därför,leta efter temperaturen med det lägsta Ct-värdet, vilket är den bästa temperaturen för att förstärka den sekundära strukturmallen!Naturligtvis måste smarta dårar veta att om det inte är nödvändigt är det bäst att byta primers och undvika den sekundära strukturregionen.
5. Användningsnivå
MIQE—Dataanalys

Dataanalysen ges huvudsakligen av det fluorescerande kvantitativa PCR-instrumentet.I den tidigare artikeln har en hel del dataanalysarbete gjorts, som till exempel blankkontrollen, som har förklarats i utformningen av experimentet.De interna referensgenerna, upprepningsnumren etc. har klargjorts., här förklarar vi främst tillämpningen av qPCR.
qPCR används flitigt, och experimentell verifiering och nukleinsyradiagnos är de mest använda scenarierna.
absolut kvantifiering
Log (initial koncentration) har ett linjärt samband med antalet cykler.En standardkurva kan dras från en standard med känt initialt kopietal, det vill säga det linjära förhållandet för amplifieringsreaktionen kan erhållas.Enligt provets Ct-värde kan koncentrationen i provet beräknas.Antalet mallar som ska inkluderas.

Absolut kvantitativ beräkningsmetod
Absolut kvantifiering måste baseras på standardkurvan.För att göra en standardkurva krävs en standard.Vanligtvis är standarden en plasmid erhållen genom kloning av målgenen.Varför är det en plasmid?Eftersom cirkulär plasmid-DNA är den mest stabila.Späd standardprodukten i 5 till 6 gradienter enligt dubbleringsförhållandet (10-faldig spädning), och var uppmärksam på enhetligheten vid spädning.Låt Ct-värdet falla mellan 15-30.

Standard förberedelse
Samtidigt ska provet som ska testas också spädas ut i enlighet med detta (kom ihåg utspädningsfaktorn), och Ct-värdet ska också ligga mellan 15-30.Standardprodukten + provet som ska testas läggs på maskinen tillsammans.Efter körningen gjordes en standardkurva med standardsubstansen och proverna som skulle testas fördes in i standardkurvan för att beräkna koncentrationen.
Hepatit B-virus HBV-kvantifiering är en typisk absolut kvantifiering, som kan beräkna antalet viruskopior i 1 ml blod.
Beräkning av kopienummer
Provkoncentration som ska testas (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × utspädningsfaktor
Provets molekylvikt = antal baser × 324
Kopiantalet för provet som ska testas (kopior/ul) = koncentrationen av provet som ska testas / molekylvikten för provet × 6 × 1014

Beräkningsmetod för kopians nummer

Ovanstående är beräkningsmetoden för att bestämma kvantiteten.Detta är ett matematiskt problem som kan lösas efter examen från högstadiet, och matematiska problem löses vanligtvis med datorer.Om du inte förstår kan du komma för att kommunicera.
relativ kvantifiering
Relativ kvantifiering används främst inom vetenskaplig forskning.Hur många virus finns det i 1 ml blod, och det är ett DNA-virus, detta är en relativt deterministisk händelse: mängden blod kan bestämmas och DNA-viruset är relativt stabilt.Det är dock svårt för oss att jämföra antalet transkriptionskopior av en viss gen i ett blad, eftersom det är svårt att bestämma storleken, vikten och ömheten hos bladet, mängden extraherat RNA är svår att fastställa och effektiviteten av omvänd transkription är också svår att fastställa, det vill säga, vilket steg som helst kan göra att experimentdata har buggar och inte kan användas.
Därför måste relativ kvantifiering införa ett element:den interna referensgenen.
Med andra ord är relativ kvantifiering faktiskt en jämförelse mellan målgenen och den interna referensgenen.Jämfört i samma vävnad och samma cell är inverkan av provstorlek, RNA-extraktionsmängd, omvänd transkriptionseffektivitet och PCR-effektivitet relativt liten.På grund av den lilla provstorleken var både interna referensgener och målgener relativt reducerade.Det är därför vi tidigare har betonat enhetlighet och stabilitet.
Interna referensgener är i allmänhethushållningsgener(hushållningsgener), som hänvisar till en klass av gener som är stabilt uttryckta i alla celler, och deras produkter är nödvändiga för att upprätthålla cellers grundläggande livsaktiviteter.
Blanda inte ihop detta koncept.Hushållningsgener är biologiska funktionstermer, medan interna referensgener är experimentella tekniska termer.Hushållningsgener måste genomgå validering innan de kan väljas som interna referensgener.
Till exempel valde vi flera hushållningsgener i figuren nedan för att testa deras uttrycksnivåer i olika vävnadsceller, och fann att uttrycksnivåerna för β-2-mikroglobulin var ganska olika från de andra tre generna, så de kunde inte användas som interna referensgener.

Efter att ha förstått korrigeringsfunktionen för den interna referensgenen, härleds två algoritmer på grund av introduktionen av den interna referensgenen.
· dubbel standard kurvmetod
·2 – △△Ct-metod (CT-värdesjämförelsemetod)
Om du är intresserad av att studera arter och genfunktioner, vänligen ge upp forskningen om algoritmer och använd formler direkt, eller använd maskiner direkt;om du är en hetero kille i matematik och ingenjörskonst, var vänlig.
dubbelstandardkurvametod
Kvantifiera målgenen och hushållningsgenen för kontrollprovet och provet som ska testas genom standardkurvan, och beräkna sedan det relativa värdet enligt beräkningsformeln, som är den relativa uttrycksnivån.
Fördelar: enkel analys, relativt enkel experimentell optimering
Nackdel: För varje gen måste varje omgång av experiment göra en standardkurva
Tillämpning: En av de två vanligaste och mest erkända relativa kvantitativa metoderna för att studera genuttrycksreglering
Formeln är följande:

Exempel är följande:

Beräkna den relativa mängden baserat på det kvantitativa resultatet
2 – △△Ct-metod (CT-värdesjämförelsemetod)

Fördelar: Inget behov av att göra en standardkurva
Nackdelar: Det antas att amplifieringseffektiviteten är nära 100 %;standardavvikelsen är < 5 %, och standardkurvan och effektiviteten mellan varje amplifiering antas vara konsekventa;optimeringen av experimentella förhållanden är mer komplicerad.
Tillämpning: En av de två vanligaste och mest erkända relativa kvantitativa metoderna för att studera genuttrycksreglering

Naturligtvis är amplifieringseffektiviteten vanligtvis omöjlig att vara perfekt 1. Korrigeringsmetod: Om vi ​​vet att målgenen och referensgenen har samma amplifieringseffektivitet, men amplifieringseffektiviteten inte är lika med 1, så kan 2－△△Ct korrigeras som: (1+E )－△△Ct, kan t.ex. .95－△△Ct
Hittills har innehållet om fluorescerande kvantitativ PCR tagit slut.