Förklaring av grundläggande molekylärbiologiska termer
1. cDNA och cccDNA: cDNA är ett dubbelsträngat DNA syntetiserat av omvänt transkriptas från mRNA;cccDNA är en plasmid dubbelsträngat sluten cirkulär DNA fri från kromosomen.
2. Standardvikningsenhet: proteinets sekundära strukturenhet α-helix och β-sheet kan bilda strukturella block med speciella geometriska arrangemang genom olika förbindande polypeptider.Denna typ av bestämd vikning brukar kallas supersekundär struktur.Nästan alla tertiära strukturer kan beskrivas av dessa vikningstyper, och även deras kombinerade typer, så de kallas också standardvikningsenheter.
3. CAP: cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) receptorprotein CRP (cAMP receptorprotein), komplexet som bildas efter kombinationen av cAMP och CRP kallas aktiverande protein CAP (cAMP aktiverat protein)
4. Palindromisk sekvens: Den omvända komplementära sekvensen av ett segment av ett DNA-fragment, ofta ett restriktionsenzymställe.
5. micRNA: Komplementärt interfererande RNA eller antisens-RNA, som är komplementärt till mRNA-sekvensen och kan hämma translationen av mRNA.
6. Ribozyme: RNA med katalytisk aktivitet, som spelar en autokatalytisk roll i splitsningsprocessen av RNA.
7. Motiv: Det finns några lokala regioner med liknande tredimensionell form och topologi i den rumsliga strukturen hos proteinmolekyler
8. Signalpeptid: en peptid med 15-36 aminosyrarester vid N-terminalen under proteinsyntes, som styr proteinets transmembran.
9. Attenuator: En nukleotidsekvens mellan en operatorregion och en strukturell gen som avslutar transkription.
10. Magisk punkt: När bakterierna växer och stöter på en fullständig brist på aminosyror, kommer bakterierna att producera en nödrespons för att stoppa uttrycket av alla gener.Signalerna som genererar denna nödsituation är guanosin-tetrafosfat (ppGpp) och guanosinpentafosfat (pppGpp).Rollen för PpGpp och pppGpp är inte bara en eller några få operoner, utan påverkar ett stort antal av dem, så de kallas superregulatorer eller magiska fläckar.
11. Uppströmspromotorelement: avser DNA-sekvensen som spelar en reglerande roll i promotorns aktivitet, såsom TATA i -10-regionen, TGACA i -35-regionen, förstärkare och attenuatorer.
12. DNA-sond: ett märkt DNA-segment med en känd sekvens, som används allmänt för att detektera okända sekvenser och screena målgener.
13. SD-sekvens: Det är bindningssekvensen för ribosom och mRNA, som reglerar translation.
14. Monoklonal antikropp: En antikropp som endast verkar mot en enda antigen determinant.
15. Kosmid: Det är en artificiellt konstruerad exogen DNA-vektor som behåller COS-regionerna i båda ändarna av fagen och är kopplad till plasmiden.
16. Blåvit fläckscreening: LacZ-genen (kodar β-galaktosidas), enzymet kan sönderdela det kromogena substratet X-gal (5-brom-4-klor-3-indol-β-D-galaktosid) för att producera blått, vilket gör stammen blå.När det exogena DNA:t sätts in kan LacZ-genen inte uttryckas, och stammen är vit, för att screena de rekombinanta bakterierna.Detta kallas blå-vit screening.
17. Cis-verkande element: En specifik sekvens av baser i DNA som reglerar genuttryck.
18. Klenow-enzym: Stort fragment av DNA-polymeras I, förutom att 5' 3'-exonukleasaktiviteten avlägsnas från DNA-polymeras I-holoenzymet
19. Förankrad PCR: används för att amplifiera DNA av intresse med en känd sekvens i ena änden.En poly-dG-svans sattes till ena änden av den okända sekvensen, och sedan användes poly-dC och den kända sekvensen som primrar för PCR-amplifiering.
20. Fusionsprotein: Genen av eukaryot protein är kopplad till exogen gen, och proteinet som består av translationen av det ursprungliga genproteinet och exogent protein uttrycks samtidigt.
Andra molekylärbiologiska termer
1. Den fysiska kartan över DNA är den ordning i vilken (restriktionsendonukleas-digererade) fragmenten av DNA-molekylen är ordnade.
2. Klyvningen av RNas är uppdelad i två typer (autokatalys) och (heterokatalys).
3. Det finns tre initieringsfaktorer i prokaryoter är (IF-1), (IF-2) och (IF-3).
4. Transmembranproteiner kräver vägledning (signalpeptider), och rollen som proteinförmedlare är (hjälper till att vika peptidkedjan till proteinets naturliga konformation).
5. Element i promotorer kan generellt delas in i två typer: (kärnpromotorelement) och (uppströms promotorelement).
6. Molekylärbiologins forskningsinnehåll omfattar huvudsakligen tre delar: (strukturell molekylärbiologi), (genuttryck och reglering) och (DNA-rekombinationsteknologi).
7. De två nyckelexperiment som visar att DNA är det genetiska materialet är (pneumokockinfektion hos möss) och (T2-faginfektion av Escherichia coli).potential).
8. Det finns två huvudsakliga skillnader mellan hnRNA och mRNA: (hnRNA splitsas i processen att omvandlas till mRNA), (5'-änden av mRNA tillsätts med ett m7pGppp-lock, och det finns en extra polyadenylering i 3'-änden av mRNA-syrans (polyA)-svans).
9. Fördelarna med multi-subenhetsformen av protein är (subenhet är en ekonomisk metod för DNA-användning), (kan minska effekten av slumpmässiga fel i proteinsyntes på proteinaktivitet), (aktivitet kan vara mycket effektivt och snabbt öppnas och stängs).
10. Huvudinnehållet i proteinveckningsmekanismens första kärnbildningsteori inkluderar (kärnbildning), (strukturell anrikning), (slutlig omarrangemang).
11. Galaktos har en dubbel effekt på bakterier;å ena sidan (det kan användas som en kolkälla för celltillväxt);å andra sidan (det är också en komponent i cellväggen).Därför behövs en cAMP-CRP-oberoende promotor S2 för den permanenta syntesen på bakgrundsnivån;samtidigt behövs en cAMP-CRP-beroende promotor S1 för att reglera syntesen på hög nivå.Transkription startar från (S2) med G och från (S1) utan G.
12. Rekombinant DNA-teknologi är också känd som (genkloning) eller (molekylär kloning).Det slutliga målet är (att överföra den genetiska informationens DNA i en organism till en annan organism).Ett typiskt DNA-rekombinationsexperiment inkluderar vanligtvis följande steg: (1) Extrahera målgenen (eller den exogena genen) från donatororganismen och koppla den enzymatiskt till en annan DNA-molekyl (kloningsvektor) för att bilda en ny rekombinant DNA-molekyl.② Den rekombinanta DNA-molekylen överförs till mottagarcellen och replikeras i mottagarcellen.Denna process kallas transformation.③ Undersök och identifiera de mottagarceller som har absorberat det rekombinanta DNA:t.④Odla cellerna som innehåller rekombinant DNA i stora mängder för att upptäcka om genen för främmande bistånd uttrycks.
13. Det finns två typer av plasmidreplikation: de som är strikt kontrollerade av värdcellproteinsyntes kallas (tighta plasmider), och de som inte är strikt kontrollerade av värdcellproteinsyntes kallas (avslappnade plasmider).
14. PCR-reaktionssystemet bör ha följande villkor: a.DNA-primrar (cirka 20 baser) med komplementära sekvenser i vardera änden av de två strängarna av målgenen som ska separeras.b.Enzymer med termisk stabilitet såsom: TagDNA-polymeras.c, dNTPd, DNA-sekvens av intresse som mall
15. Den grundläggande reaktionsprocessen för PCR inkluderar tre steg: (denaturering), (annealing) och (extension).
16. Den grundläggande processen för transgena djur inkluderar vanligtvis: ①Införande av klonad främmande gen i kärnan av ett befruktat ägg eller embryonal stamcell;②Transplantation av det inokulerade befruktade ägget eller embryonala stamcellen till den kvinnliga livmodern;③Fullständig embryonal utveckling och tillväxt För avkomman med främmande gener;④ Använd dessa djur som kan producera främmande proteiner som avelsdjur för att föda upp nya homozygota linjer.
17. Hybridomcellinjer genereras genom att hybridisera (mjälte B) celler med (myelom)celler, och eftersom (mjältceller) kan använda hypoxantin och (benceller) tillhandahålla celldelningsfunktioner, kan de odlas i HAT-medium.växa.
18. Med fördjupningen av forskningen kallas den första generationen antikroppar (polyklonala antikroppar), den andra generationen (monoklonala antikroppar) och den tredje generationen (genteknikantikroppar).
19. För närvarande är gentekniken av insektsvirus huvudsakligen inriktad på baculovirus, vilket manifesteras i införandet av (exogen toxingen);(gener som stör den normala livscykeln för insekter);(modifiering av virusgener).
20. De transverkande proteinfaktorerna som motsvarar de gemensamma elementen TATA, GC och CAAT i däggdjurs-RNA-polymeras II-promotorn är (TFIID), (SP-1) respektive (CTF/NF1).
tjugoett.De grundläggande transkriptionsfaktorerna för RNA-polymeras Ⅱ är TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, och deras bindningssekvens är: (D, A, B, E).Där funktionen för TFII-D är (bindande till TATA-box).
tjugotvå.De flesta av de transkriptionsfaktorer som binder till DNA fungerar i form av dimerer.De funktionella domänerna för transkriptionsfaktorer som binder till DNA är vanligtvis följande (helix-turn-helix), (zinkfingermotiv), (basic-leucin) blixtlåsmotiv).
tjugotre.Det finns tre typer av restriktionsendonukleasklyvningslägen: (skär vid 5'-sidan av symmetriaxeln för att generera 5'-klibbiga ändar), (klipp på 3'-sidan av symmetriaxeln för att generera 3'-klibbiga ändar (klipp vid symmetriaxeln för att generera platta segment) ).
tjugofyra.Plasmid-DNA har tre olika konfigurationer: (SC-konfiguration), (oc-konfiguration), (L-konfiguration).Den första i elektrofores är (SC-konfiguration).
25. Exogena genuttryckssystem, främst (Escherichia coli), (jäst), (insekt) och (däggdjurscelltabell).
26. De vanligaste metoderna för transgena djur är: (retroviral infektionsmetod), (DNA-mikroinjektionsmetod), (embryonal stamcellsmetod).
Tillämpning Molekylärbiologi
1. Nämn funktionerna för mer än 5 RNA?
Överför RNA tRNA Överför aminosyra Ribosom RNA rRNA Ribosom utgör budbärare RNA mRNA Proteinsyntesmall Heterogen nukleär RNA hnRNA Prekursor för moget mRNA litet nukleärt RNA snRNA Inblandat i hnRNA splitsning Litet RNA scRNA/7SL-RNA cytoplasmatiskt RNA scRNA/7SL-RNA cytoplasmatiskt RNA scRNA/7SL-RNA syntetiserat cytoplasmatiskt RNA, RNA syntetiserat RNA återuppbyggt och RNA syntetiserat RNA återuppbyggnads- och RNA-signal kropp /micRNA Reglerar genuttryck Ribozyme RNA Enzymatiskt aktivt RNA
2. Vad är den största skillnaden mellan prokaryota och eukaryota promotorer?
Prokaryot TTGACA --- TATAAT------Initieringsställe-35 -10 Eukaryot Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Initieringsställe-110 -70 -25
3. Vilka är de viktigaste aspekterna av artificiell konstruktion av naturliga plasmider?
Naturliga plasmider har ofta defekter, så de är inte lämpliga för användning som bärare för genteknik, och måste modifieras och konstrueras: a.Lägg till lämpliga selektionsmarkörgener, såsom två eller flera, som är lätta att använda för selektion, vanligtvis antibiotikagener.b.Öka eller minska lämpliga enzymskärningsställen för att underlätta rekombination.c.Förkorta längden, skär bort onödiga fragment, förbättra importeffektiviteten och öka lastkapaciteten.d.Ändra repliken, från tight till lös, från färre kopior till fler kopior.e.Lägg till speciella genetiska element enligt de speciella kraven för genteknik
4. Ge ett exempel på en metod för differentiell screening av vävnadsspecifikt cDNA?
Två cellpopulationer bereds, målgenen uttrycks eller uttrycks i hög grad i en av cellerna, och målgenen uttrycks inte eller uttrycks lågt i den andra cellen, och sedan hittas målgenen genom hybridisering och jämförelse.Till exempel, under förekomsten och utvecklingen av tumörer kommer tumörceller att presentera mRNA med andra uttrycksnivåer än normala celler.Därför kan tumörrelaterade gener screenas bort genom differentiell hybridisering.Induktionsmetoden kan också användas för att sålla bort de gener vars uttryck induceras.
5. Generering och screening av hybridomcellinjer?
Mjälte B-celler + myelomceller, tillsätt polyetylenglykol (PEG) för att främja cellfusion, och mjältens B-myelomfusionsceller odlade i HAT-medium (innehållande hypoxantin, aminopterin, T) fortsätter att expandera näring.Cellfusionen innehåller: mjälte-mjälte-fusionsceller: oförmögna att växa, mjältceller kan inte odlas in vitro.Ben-benfusionsceller: kan inte använda hypoxantin, men kan syntetisera purin genom den andra vägen med folatreduktas.Aminopterin hämmar folatreduktas och kan därför inte växa.Ben-mjälte-fusionsceller: kan växa i HAT, mjältceller kan använda hypoxantin och benceller ger celldelningsfunktion.
6. Vilken är principen och metoden för att bestämma DNAs primära struktur med dideoxiterminaltermineringsmetoden (Sanger-metoden)?
Principen är att använda en nukleotidkedjeterminator-2,,3,-dideoxinukleotid för att avsluta förlängningen av DNA.Eftersom den saknar den 3-OH som krävs för bildning av 3/5/fosfodiesterbindningar, när den väl har införlivats i DNA-kedjan, kan DNA-kedjan inte förlängas ytterligare.Enligt principen för basparning, närhelst DNA-polymeras behöver dNMP för att delta i den normalt förlängda DNA-kedjan, finns det två möjligheter, en är att delta i ddNTP, vilket resulterar i att deoxinukleotidkedjeförlängningen avbryts;den andra är att delta i dNTP, så att DNA-kedjan fortfarande kan fortsätta att sträcka sig tills nästa ddNTP är inkorporerad.Enligt denna metod kan en grupp av DNA-fragment av olika längder som slutar på ddNTP erhållas.Metoden är att dela in i fyra grupper, respektive ddAMP, ddGMP, ddCMP och ddTMP.Efter reaktionen kan polyakrylamidgelelektrofores avläsa DNA-sekvensen enligt simbanden.
7. Vilken är den positiva regleringseffekten av aktivatorprotein (CAP) på transkription?
Cyklisk adenylat (cAMP) receptorprotein CRP (cAMP receptorprotein), komplexet som bildas av kombinationen av cAMP och CRP kallas CAP (cAMPaktiverat protein).När E. coli odlas i ett medium som saknar glukos ökar syntesen av CAP, och CAP har funktionen att aktivera promotorer såsom laktos (Lac).Vissa CRP-beroende promotorer saknar den typiska -35-regionsekvensegenskapen (TTGACA) som vanliga promotorer har.Därför är det svårt för RNA-polymeras att binda till det.Närvaron av CAP (funktion): kan avsevärt förbättra bindningskonstanten för enzym och promotor.Den visar huvudsakligen följande två aspekter: ① CAP hjälper enzymmolekylen att orientera sig korrekt genom att ändra konformationen av promotorn och interaktionen med enzymet, så att den kombineras med -10-regionen och spelar rollen att ersätta funktionen av -35-regionen.②CAP kan också hämma bindningen av RNA-polymeras till andra ställen i DNA, och därigenom öka sannolikheten för bindning till dess specifika promotor.
8. Vilka steg ingår vanligtvis i ett typiskt DNA-rekombinationsexperiment?
a.Extrahera målgenen (eller exogena genen) från donatororganismen och koppla den enzymatiskt till en annan DNA-molekyl (kloningsvektor) för att bilda en ny rekombinant DNA-molekyl.b.Överför den rekombinanta DNA-molekylen till mottagarcellen och replikera och bevara den i mottagarcellen.Denna process kallas transformation.c.Screen och identifiera de mottagarceller som har absorberat det rekombinanta DNA:t.d.Massodla cellerna som innehåller det rekombinanta DNA:t för att detektera om genen för främmande bistånd uttrycks.
9. Konstruktion av genbibliotek Tre metoder för screening av rekombinanter ges och processen beskrivs kortfattat.
Antibiotikaresistensscreening, insertionsinaktivering av resistens, blåvit-fläckscreening eller PCR-screening, differentiell screening, DNA-sond De flesta kloningsvektorer bär antibiotikaresistensgener (anti-ampicillin, tetracyklin).När plasmiden överförs till Escherichia coli, kommer bakterierna att förvärva resistens, och de utan överföring kommer inte att ha resistens.Men den kan inte skilja på om den har omorganiserats eller inte.I en vektor som innehåller två resistensgener, om ett främmande DNA-fragment sätts in i en av generna och gör att genen inaktiveras, kan två plattkontroller som innehåller olika läkemedel användas för att screena för positiva rekombinanter.Till exempel innehåller pUC-plasmiden LacZ-genen (som kodar för β-galaktosidas), som kan sönderdela det kromogena substratet X-gal (5-brom-4-klor-3-indol-β-D-galaktosid) för att producera blått, vilket gör att stammen blir blå.När det främmande DNA:t sätts in kan LacZ-genen inte uttryckas, och stammen är vit, för att screena de rekombinanta bakterierna.
10. Förklara den grundläggande processen för att få transgena djur genom embryonala stamceller?
Embryonala stamceller (ES) är embryonala celler under embryonal utveckling, som kan artificiellt odlas och förökas och har funktionen att differentiera till andra typer av celler.Odling av ES-celler: Blastocystens inre cellmassa isoleras och odlas.När ES odlas i ett foderfritt lager, kommer det att differentiera till olika funktionella celler såsom muskelceller och N-celler.När ES odlas i ett medium som innehåller fibroblaster kommer ES att bibehålla differentieringsfunktionen.ES kan manipuleras genetiskt, och dess differentieringsfunktion kan integreras utan att påverka dess differentieringsfunktion, vilket löser problemet med slumpmässig integration.Introducera exogena gener i embryonala stamceller, implantera sedan i livmodern på gravida honmöss, utvecklas till ungar och korsas för att erhålla homozygota möss.
