Escherichia Coli O157: H7 nukleinsyradetektionskit (PCR-fluorescerande sondmetod/frystorkning)
Kit Beskrivning:
Kat.nr.FP103
Den används för snabb upptäckt och screening av E. coli O157:H7 i livsmedel, foder, vattenprover och miljöprover.
Beskrivningar
Den används försnabb upptäckt och screening av E. coli O157:H7 i livsmedel, foder, vattenprover och miljöprover.
[Testprincip]
Enligt principen för fluorescerande PCR-teknologi är specifika primrar och Taqman-prober designade för den specifika genen av Escherichia coli O157: H7, och detekteras av ett fluorescerande PCR-instrument, för att realisera detektionen av Escherichia coli O157: H7 Kvalitativ detektion av DNA.
Kit Innehåll
Obs: ROX-kanalsond ingår inte.
| Componenter | Specifikation | Qmängd |
| Buffert A | Rör | 1 |
| Buffert B | Rör | 1 |
| Positiv kontroll | Rör | 1 |
| Negativ kontroll | Rör | 1 |
Förväntad användning
Den används för snabb upptäckt och screening av E. coli O157:H7 i livsmedel, foder, vattenprover och miljöprover.
Förvaringsvillkor och utgångsdatum
Förvara vid -20℃ i mörker och undvik upprepad frysning och upptining.
Giltighetstiden är 12månader, och produktionsdatumet anges på ytterförpackningen.
Instrument och förbrukningsvaror
Fluorescerande kvantitativt PCR-instrument, pipettpistol och matchande spetsar, vortexskakare, minicentrifug.
Användande
1. Provbearbetning
1.1 Provtyp: Detta kit är lämpligt för livsmedel, foder, vattenprover och andra prover som misstänks vara kontaminerade av Escherichia coli O157:H7.För djupförädlade köttprodukter, drycker och andra ämnen som innehåller pigment måste de sköljas för att undvika att påverka fluorescenssignaluppsamlingen.
1.2 Provbearbetning: Se "GB 4789.10-2016 Food Safety National Standard Food Microbiological Examination of Escherichia coli O157: H7 Test" för provberedning, anrikningsodling och isolering av Escherichia coli O157: H7.
- Nukleinsyraextraktion
Ta 20 mL anrikningslösning i ett 1,5 mL centrifugrör, tillsätt 200 μL mikrobiellt lysat (ytterligare kit krävs), vortexa i 30 sekunder, centrifugera kort och ställ åt sidan.
Anmärkningar: Extraktionen av nukleinsyra från lysatet bör slutföras inom 10 minuter och kan inte lagras under lång tid.
3. Nukleinsyraamplifiering
3.1 Slå på det fluorescerande kvantitativa PCR-instrumentet för användning.
Buffert A och Buffert B från satsen, smält dem ordentligt och centrifugera kort.Tillsätt 18 μL Buffert A och 2 μL Buffert B till varje PCR-reaktionsrör.Tillsätt sedan 5 mL vardera av den negativa kontrollen, den extraherade nukleinsyran och den positiva kontrollen i PCR-reaktionsrören, lock på rören och centrifugera kort.
3.3 Överför PCR-reaktionsröret till en fluorescerande PCR-maskin och använd följande procedurer för att utföra amplifieringsexperiment: välj 25 mL för reaktionssystemet, samla in fluorescenssignaler vid 60°C för varje cykel och välj FAM för detektionskanalen.
| Steg | Program | Antal cykler |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (samla fluorescens) |
Guider för problemanalys
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Inget RNA kan extraheras eller så är utbytet av nukleinsyra lågt
Det finns vanligtvis många faktorer som påverkar återvinningseffektiviteten, såsom: provets RNA-innehåll, driftsmetod, elueringsvolym, etc.。
Analys av vanliga orsaker:
1.Isbad eller lågtemperatur (4 °C) centrifugering under drift.
Förslag: Drift i rumstemperatur (15-25 ° C), aldrig isbad och lågtemperaturcentrifug.
2. Felaktig provförvaring eller provförvaring för länge.
Förslag: Förvara prover vid -80 ° C eller frys in i flytande kväve och undvik upprepad frys-upptining;försök att använda nyligen insamlade prover för RNA-extraktion.
3.Otillräcklig provlys
Rekommendation: Se till att provet och arbetslösningen (Linear Acrylamid) har blandats noggrant och inkuberats i 10 minuter vid rumstemperatur (15-25 ° C)
4. Eluenten tillsattes felaktigt
Rekommendation: Se till att RNase-Free ddH2O tillsätts i mitten av membranet i reningskolonnen
5. Felaktig volym vattenfri etanol i buffert viRW2
Förslag: Vänligen följ instruktionerna, tillsätt rätt volym vattenfri etanol till Buffer viRW2 och blanda dem väl innan du använder kitet.
6. Felaktig provanvändning.
Förslag: 200 µl prov per 500 µl buffert viRL.Överdriven provvolym kommer att resultera i minskad RNA-extraktionshastighet.
7. Felaktig elueringsvolym eller ofullständig eluering.
Förslag: Eluentvolymen i reningskolonnen är 30-50μl;om elueringseffekten inte är tillfredsställande, rekommenderas att tillsätta förvärmd RNase-fri ddH2O och förläng tiden vid rumstemperatur, såsom 5-10 min
8.Reningskolonnen har etanolrester efter sköljning i buffert viRW2.
Förslag: Om etanol fortfarande finns kvar efter sköljning i buffert viRW2 och tomrörscentrifugering i 2 minuter, kan reningskolonnen lämnas i rumstemperatur i 5 minuter efter tomrörscentrifugering för att helt avlägsna återstående etanol.
Nedbrytningen av renade RNA-molekyler
Kvaliteten på det renade RNA:t är relaterat till faktorer som provlagring, RNas-kontamination och drift.
Analys av vanliga orsaker:
1.De insamlade proverna sparades inte i tid.
Förslag: Om provet inte används i tid efter insamling, vänligen förvara det vid -80 ℃ eller flytande kväve omedelbart.För extraktion av RNA-molekyler, försök att använda nyligen insamlade prover när det är möjligt.
2. Samlade prover frystes och tinades upprepade gånger.
Förslag: Undvik upprepad frysning och upptining (högst en gång) under provtagning och förvaring, annars kommer utbytet av nukleinsyra att minska.
3.RNase infördes i operationssalen eller så användes inga engångshandskar, masker etc..
Förslag: Experimentet med extraktion av RNA-molekyler utförs bäst i ett separat RNA-operationsrum, och experimentbordet rengörs före experimentet.Bär engångshandskar och -masker under experimentet för att undvika RNA-nedbrytning orsakad av RNase-introduktion.
4. Reagenset är kontaminerat av RNase under användning.
Förslag: Ersätt med nytt viralt RNA-isoleringskit för relaterade experiment.
5. RNase-kontaminationen av centrifugrören, pipettspetsarna, etc. Förslag: Se till att centrifugrören, pipettspetsarna och pipetterna alla är RNase-fria.
De renade RNA-molekylerna påverkade experiment nedströms
RNA-molekylerna som renas av reningskolonnen kommer att påverka nedströmsexperiment om det finns för mycket saltjoner eller proteiner, såsom: omvänd transkription, Northern Blot, etc.。
1. Det finns kvarvarande saltjoner i de eluerade RNA-molekylerna.
Rekommendation: Se till att rätt volym vattenfri etanol har tillsatts till Buffer viRW2 och tvätta reningskolonnen två gånger enligt rätt centrifugeringshastighet i bruksanvisningen. Om det fortfarande finns saltjoner kvar kan du tillsätta Buffer viRW2 till reningskolonnen och lämna den i rumstemperatur i 5 minuter.Utför sedan centrifugering för att ta bort föroreningar med saltjoner i största utsträckning
2. Det finns kvarvarande etanol i de eluerade RNA-molekylerna
Förslag: när du har bekräftat att reningskolonner har sköljts av Buffer viRW2, utför tomrörscentrifugering enligt centrifugalhastigheten i bruksanvisningen.Om det fortfarande finns etanol kvar kan den lämnas i rumstemperatur i 5 minuter efter en tomrörscentrifugering för att avlägsna resterande etanol i största utsträckning.
Instruktionsmanualer:
Instruktionsbok för viral RNA-isoleringskit
