Vi har varit erfaren tillverkare.Vinner majoriteten i de avgörande certifieringarna på sin marknad för stora rabatter Kina High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kvalitet är fabrikens liv, Fokus på kundernas efterfrågan är källan till företagets överlevnad och utveckling, Vi följer ärlighet och arbetsattityd i god tro, ser fram emot att du kommer!
Vi har varit erfaren tillverkare.Vinna majoriteten i de avgörande certifieringarna av sin marknad förKina Taq DNA-polymeras, Qpcr, Vårt företag lovar: rimliga priser, kort produktionstid och tillfredsställande service efter försäljning, vi välkomnar dig också att besöka vår fabrik när du vill.Önskar att vi nu har en trevlig och långsiktig affär tillsammans!!!

Beskrivningar

Detta kit använder ett unikt lyseringsbuffertsystem som snabbt kan frigöra RNA från odlade cellprover för RT-qPCR-reaktioner, vilket eliminerar den tidskrävande och mödosamma RNA-reningen.RNA-mallen kan erhållas på bara 7 minuter.Reagenserna 5×Direct RT Mix och 2×Direct qPCR Mix-SYBR som tillhandahålls av kitet kan snabbt och effektivt erhålla kvantitativa PCR-resultat i realtid.

5×Direct RT Mix och 2×Direct qPCR Mix-SYBR har stark inhibitortolerans, och lysatet från proverna kan användas som mall för RT-qPCR direkt.Detta kit innehåller det unika RNA-högaffinitet Foregene omvänt transkriptas och Hot D-Taq DNA-polymeras, dNTPs, MgCl₂, reaktionsbuffert, PCR-optimeringsmedel och stabilisator.

Specifikationer

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kitkomponenter

Egenskaper & fördelar

■ Enkelt och effektivt: med Cell Direct RT-teknologi kan RNA-prov erhållas på bara 7 minuter.

■ Provbehovet är litet, så lite som 10 celler kan testas.

■ Hög genomströmning: den kan snabbt detektera RNA i celler odlade i 384, 96, 24, 12, 6-brunnars plattor.

■ DNA Eraser kan snabbt ta bort frigjorda genom, avsevärt minska påverkan på efterföljande experimentella resultat.

■ Optimerat RT- och qPCR-system gör tvåstegs RT-PCR omvänd transkription mer effektiv och PCR mer specifik och mer resistent mot RT-qPCR-reaktionshämmare.

Kitapplikation

Användningsområde: odlade celler.

- RNA frisatt genom provlys: endast tillämpligt på RT-qPCR-mallen i detta kit.

- Satsen kan användas för följande ändamål: genuttrycksanalys, verifiering av siRNA-medierad gentystnadseffekt, läkemedelsscreening, etc.

Diagram

Lagring och hållbarhet

Del I av detta kit bör förvaras vid 4 ℃;Del II bör förvaras vid -20 ℃.

Foregene Protease Plus II bör förvaras vid 4 ℃, frys inte vid -20 ℃.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR ska förvaras vid -20℃ i mörker;om den används ofta kan den också förvaras vid 4 ℃ för korttidsförvaring (använd inom 10 dagar). Vi har varit erfarna tillverkare.Vinner majoriteten i de avgörande certifieringarna på sin marknad för stora rabatter Kina High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kvalitet är fabrikens liv, Fokus på kundens efterfrågan är källan till företagets överlevnad och utveckling, Vi håller fast vid ärlighet och god tro arbetsattityd, ser fram emot att du kommer!
Stor rabattKina Taq DNA-polymeras, Qpcr, Vårt företag lovar: rimliga priser, kort produktionstid och tillfredsställande service efter försäljning, vi välkomnar dig också att besöka vår fabrik när du vill.Önskar att vi nu har en trevlig och långsiktig affär tillsammans!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.nr.DRT-01021/01022

För celldirekt RT-qPCR med ≤ 1 000 000 celler

Produkt introduktion

Denna produkt använder ett unikt lyseringsbuffertsystem för att snabbt frigöra RNA från odlade cellprover för RT-qPCR-reaktioner, vilket eliminerar den tidskrävande och mödosamma RNA-reningen, och bara 7 minuter för att erhålla den erforderliga RNA-mallen, med 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman som tillhandahålls av kitet kan snabbt och effektivt erhålla PCR-resultat i realtid.

5× Direct RT Mix och 2× Direct qPCR Mix-Taqman har stark inhibitortolerans och kan utföra effektiv reversering och specifik amplifiering med hjälp av lysatet från provet som ska mätas som en mall.Reagenset innehåller Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA-polymeras, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer och Stabilizer, som kan användas med lysbuffert för att snabbt och enkelt upptäcka prover, och har egenskaperna hög känslighet, specificitet och stabilitet.

Produktfunktioner

Enkel, effektiv Cell Direct RT-teknik som tar så lite som 7 minuter att få RNA-prover.

Provkraven är små, och minst 10 odlade celler kan användas för experiment.

Hög genomströmning för snabb RNA-insamling av odlade celler såsom 384, 96, 24, 12 och 6-brunnars plattor.

DNA Eraser kan snabbt ta bort frigjorda genom, vilket kraftigt minskar effekten på efterföljande experimentella resultat.

Optimerade RT- och qPCR-system möjliggör tvåstegs RT-PCR med effektivare omvänd transkription, specificitet och starkare RT-qPCR-reaktionshämmaretolerans.

Kitapplikation

Användningsområde: Odlade celler.

Provlys tolkat RNA: används endast som en tvåstegs RT-qPCR-mall.

Kit kan användas för följande ändamål: analys av genreglerande uttryck, alleltestning, läkemedelsscreening, etc.

Kit begränsningar

Amplifierade fragment ≤ 300 bp.

Kit används för att nyodla celler.

Produktkvalitetskontroll

Enligt FOREGENEs totala kvalitetsledningssystem testas varje sats av Cell Direct RT-qPCR-serien rigoröst flera gånger för att säkerställa tillförlitligheten och stabiliteten i kvaliteten för varje sats av satser.

Kit innehåll

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kan köpas separat, detaljer finns i Bilaga 1 (SIDA 13).

Förvaringsförhållanden

1. Leveransvillkor

Hela processen med lågtemperaturtransport av ispaket för att säkerställa att satsen är i <4 °C tillstånd.

2. Lagringsförhållanden

Förvara del I vid 4°C och del II vid -20°C.

Foregene Protease Plus II bör förvaras vid 4°C, inte frysas vid -20°C.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman förvaras vid -20°C, eller vid 4°C för kortvarig användning om den används ofta (inom 10 dagar).

Information om kitkomponenter

Buffert CL: Ger den miljö som krävs för cellysreaktioner.

Buffert ST: Avslutar den aktiva substansen i lysatet för att undvika effekter på efterföljande RT.

DNA Eraser: DNA-borttagare, effekten av att ta bort genomet på efterföljande experiment.

5× Direct RT Mix: Innehåller hög RNA-affinitet Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilisatorer, enhancers, optimizers, and reverse transcription primers for optimal alignment (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: I samband med lyseringsbuffert lyseras celler för att frigöra nukleinsyror.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Detta reagens innehåller Hot D-Taq DNA-polymeras, dNTPs, MgCl₂reaktionsbuffert, PCR-optimeringsmedel och stabilisator.

20× ROX referensfärg: Används vanligtvis på realtids-PCR-förstärkningsinstrument från ABI, Stratagene och andra företag, och används för att justera skillnaden mellan PCR-rör och -rör orsakade av PCR-doseringsfel.Den 20× ROX referensfärgkoncentration som krävs för olika instrument är olika, och användaren kan lägga till den enligt den rekommenderade koncentrationen av instrumentet.

RNase-fri ddH₂O: RNasfritt steriliserat ultrarent vatten för tvåstegs RT-qPCR-reaktioner.

Försiktighetsåtgärder:(Se till att läsa försiktighetsåtgärderna noggrant innan du använder satsen)

Var uppmärksam på operationsmetoden för experimentet för att undvika korskontaminering mellan proverna.

Var uppmärksam på renligheten i den experimentella miljön och redskap för att undvika RNas-kontamination och RNA-nedbrytning.

Ta färska eller välkonserverade cellprov och använd aldrig upprepade frys-tinade cellprover.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman bör undvika upprepad frysning-upptining, annars kommer det att påverka omvänd transkription och PCR-effektivitet.

Preparansonerinnandrift

Se till att läsa instruktionerna noggrant innan du använder detta kit.Cell Direct RT-qPCR Kit är enkelt, bekvämt och snabbt att använda, och instruktionerna ger fullständig information om hela kitet och hur man använder det korrekt.Förbered nödvändiga experimentmaterial och utrustning före användning.

Experimentellt material och utrustning

◆ Kulturceller.

◆ 1,5 ml eller 2 ml, RNase-/DNas-fritt centrifugrör, RNase-/DNas-fri spets, 0,2 ml sterilt qPCR-rör.

◆ qPCR-maskin, pipett, bordscentrifug (≥13 400×g) (beroende på försöksbehov) osv.

Säkerhet

◆ Denna produkt är endast avsedd för vetenskapliga forskningsändamål, använd den inte för farmaceutiska, kliniska, livsmedels- och kosmetiska ändamål.

◆ När du använder kemikalier, använd lämpliga labbkläder, handskar, skyddsglasögon etc.

Driftguider

Cell Lysis-system, RT-system och qPCR-reaktionslösningstilläggspaket kan köpas separat, för detaljer i Bilaga 1 (SIDA 13).

Driftguide

S: Prov RNA-frisättning

1. Celler förbehandlades: Tvätta cellodlingsplattan med kall PBS, lysera sedan cellerna (10-10⁶), 10⁶ än mängden celler, rekommenderas Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) eller Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) för RNA-extraktion och rening.

1.1.Vidhäftande celler (24-brunnars platta som ett exempel)

1.1.1.Bestäm antalet celler i varje brunn, bestäm att antalet celler är 1 × 10⁵och använd en pipett för att ta bort odlingsmediet från odlingsskålen.

1.1.2.Tillsätt 200 μl förkyld 1 × PBS till varje brunn.Pipettera inte upprepade gånger och ta bort PBS från brunnarna.Luta plattan och ta bort så mycket PBS som möjligt.Fortsätt till steg 2.

1.1.3.En annan cellodlingsskål eller ett referensnummer tabell 1-1 i en cellodlingsskål tillsattes förkyld 1 × PBS för celltvätt.

Tabell 1-1: PBS-dosering för olika antal celler

Notera:För att säkerställa en fast vidhäftande celler，ett stort antal cellförluster undviks vid tvättning.

1.2.Suspensionsceller eller vidhäftande celler odlade i icke-porösa plattor

1.2.1.Vidhäftande celler odlade i icke-multibrunnsplattor (suspensionsceller börjar från nästa steg 1.2.2), samla in och separera cellerna enligt den normala cellinsamlingsmetoden och placera dem i en odlingsplatta eller centrifugrör;om trypsinisering används, kräver centrifugering för att samla upp cellerna och för att avlägsna resterande trypsin, tillsatte PBS återsuspenderade celler till individuella celler för att dispergera cellerna.

1.2.2.Efter antalet räknade celler, alikvoterade cellerna 1×10⁵ en för att centrifugera rör, samla in celler genom centrifugering vid 1000 × g i 10 min.

1.2.3.Tillsätt 200 μl PBS till centrifugröret, pipettera inte upprepade gånger och aspirera PBS direkt.fortsätt till steg 2. (Om det är svårt att fälla ut och cellerna återsuspenderades igen, kan utföras 1000×g centrifugeras 10 minuter efter att supernatanten kasserats, fortsätter cellpelleten till steg 2)

2.Celllys: Ta bort buffert CL, dess temperatur utjämnad till rumstemperatur, DNA Eraser och Foregene Protease Plus II, enligt följande tabell 1-2 förberedda lyseringssystem: (Lyslösningen är klar för användning).

Tabell 1-2: klyvning systemberedning (Obs: i beredningen på is)

3.( 24-brunnars platta som ett exempel) Pipettera 200 μl celllys mastermix i varje brunn, blås upprepade gånger 5-10 gånger, inkubera i rumstemperatur (20-25 ℃) i 5 min.

Notera:För att undvika bildandet av bubblor, vänligen när pipetteringspipettskalan justerades till 200 μl eller mindre.Cellerna kan verka grumliga efter lysering, vilket är normalt.

4. (24-brunnsplatta som ett exempel) tillsätts i vätskan 20 μl Buffert ST (olika lyssystem Buffert ST tillsatt i en mängd som visas i Tabell 1-3), upprepad pipettering 5-10 gånger, vid rumstemperatur (20-25 ℃) inkuberades i 2 minuter.

Notera:Pipettspetsen placerad under ytan, vilket säkerställer att lysatet tillsattes，För att undvika bildandet av bubblor, vänligen när pipetteringspipettskalan justerades till 200 μl eller mindre.

Tabell 1-3:Lägg till buffert ST

5. Lysatet används för efterföljande RT-qPCR-experiment.Om de efterföljande experimenten inte kan utföras i tid, håll den på is i högst 2 timmar och förvara vid -20 ℃ eller -80 ℃ (högst tre månader).

B: Förberedelse av RT-system

1. Ta ut 5 × Direct RT Mix och lägg den på ett isbad, låt den smälta naturligt och blanda försiktigt för senare användning;ta ut RNase-fri ddH2O och smält den och lägg den på ett isbad för senare användning.Förbered reaktionssystemet på is enligt Tabell 2-1 nedan.

Tabell 2-1: Beredning av RT-reaktionssystem

2. Efter avslutad systemformulering blandas försiktigt och centrifugeras kort i följande tabell 2-2 reaktionsförhållanden RT-reaktion.

Tabell 2-2: Inställning av RT-reaktionsvillkor

3. Efter slutförandet av reaktionen placerades reaktionsprodukten direkt på is för qPCR, vänligen lägg långtidskonserveringen -20 ℃ eller -80 ℃.

Obs: På grund av användningen av icke-renad mall kan vita fällningar förekomma i produkten omvänd transkription.Detta är ett normalt fenomen.Centrifugera supernatanten omedelbart för efterföljande experiment.

Den resulterande RT-reaktionslösningen tillsätts till nästa steg realtids-PCR-reaktionssystem, det rekommenderas att tillsätta mängder från 10-30 % av reaktionssystemet.

C: beredning av qPCR-reaktionssystem

1. Lämplig mängd B framställd i steg cDNA-mall enligt följande tabell 3-1 för att framställa ett reaktionssystem.

Obs: Mängden cDNA-mall står för 10-30 % av qPCR-systemet.Till exempel, i ett 20μl qPCR-system, tillsätt 2-6 μl lysbuffert, men inte mer än 6 μl.

2. Optimeringen av goda qPCR-förhållanden (glödgningstemperatur, etc.) för qPCR-reaktion (reaktionsbetingelserna i Tabell 3-2).

Obs: Försök att använda optimerade förhållanden för qPCR-reaktioner för att få bättre resultat.

Tabell 3-1: Framställning av PCR-reaktionssystem

1*: Primerkoncentrationen kan justeras i intervallet 50-900 nM när primerreaktionsprestanda är dålig.

Obs: qPCR-systemet kan justeras enligt experimentella behov och fluorescenscykelmodell.För qPCR i en 50μl system, justera reagensdoseringen proportionellt enligt 20μl system.

2*: Välj lämplig slutkoncentration av ROX Reference Dye enligt den kvantitativa termiska cyklern för fluorescens.De mest lämpliga ROX-referensfärgämneskoncentrationerna för vanliga kvantitativa fluorescenscykler visas i tabellen nedan:

Tabell 3-2: qPCR-reaktionsförhållanden tillhandahålls

Obs: För att få den bästa qPCR-effekten kan gradient-PCR användas för att optimera reaktionsförhållandena för olika mallar och olika primrar.PCR-reaktionsförhållandena varierar beroende på fluorescensanalysatorn, mallen, primern, etc. I den specifika operationen måste de optimala reaktionsförhållandena utformas enligt de specifika förhållandena för den fluorescens kvantitativa termiska cyklern, malltyp, storleken på fragmentet av intresse, bassekvens för det amplifierade fragmentet och GC-innehåll och längd på primrar, inklusive reaktionstid, etc.

Real Time PCR primer designprinciper

Forward Primer och Reverse Primer

För realtids-PCR är primerdesign mycket viktigt.Primers är relaterade till specificiteten och effektiviteten av PCR-amplifiering och kan utformas med hänvisning till följande principer:

◆ Primerlängd: 18-30bp.

◆ GC-halt: 40-60%.

◆ Tm-värde: Primerdesignprogramvara, såsom Primer 5, kan ge primerns Tm-värde.Tm-värdena för uppströms och nedströms primers bör vara så nära som möjligt.Tm-beräkningsformeln kan också användas: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).När PCR utförs väljs i allmänhet en temperatur under primerns Tm-värde på 5 °C som glödgningstemperatur (motsvarande ökning av glödgningstemperaturen kan öka specificiteten för PCR-reaktionen).

◆ Primers och PCR-produkter:

◆ Design primer PCR-amplifieringsproduktens längd är företrädesvis 100-150 bp.

◆ Designprimer i mallens sekundära strukturella område bör undvikas så mycket som möjligt.

◆ Undvik bildandet av 2 eller flera komplementära baser mellan 3′-ändarna av uppströms och nedströms primers.

◆ Primer 3′ terminalbas kan inte finnas med ytterligare 3 på varandra följande G eller C.

◆ Själva primrarna kan inte ha komplementära strukturer, annars kommer en hårnålsstruktur att bildas som påverkar PCR-amplifieringen.

◆ ATCG bör fördelas så jämnt som möjligt i primersekvensen, och den 3′ terminala basen bör undvikas som T.

Bilaga1:Cell direktRT-qPCR Kit komponentt tilläggspaket

1. Celllyslösning