Sterilisering av pipettspetsar och EP-rör mm.

1. Förbered 0,1 % (en tusendel) DEPC (mycket giftigt ämne) med avjoniserat vatten, använd det försiktigt i ett dragskåp och förvara det vid 4°C borta från ljus;

DEPC-vatten är rent vatten behandlat med DEPC och steriliserat med hög temperatur och högt tryck.Testad för att vara fri från RNas, DNas och proteinas.

2. Sätt pipettspetsen och EP-röret i 0,1 % DEPC och se till att pipettspetsen och EP-röret är fyllda med 0,1 % DEP.

3. Skydda från ljus, låt stå över natten (12-24h)

4. Lådan som innehåller spetsen och EP-röret behöver inte blötläggas i DEPC.Efter att ha grovt tagit bort DEPC-vattnet i spetsen eller EP-röret, packa ihop det och slå in det.

5. 121 grader Celsius, 30min

6. 180 grader Celsius, torka i flera timmar (minst 3 timmar)

Obs: a.Bär latexhandskar och masker vid hantering av DEPC!b, eller utan DEPC-sterilisering, 130 ℃, 90 min autoklav (många laboratorier högtemperatursterilisering två gånger)

RNA-extraktionsöverväganden

Två stora fenomen av vävnads-RNA-isoleringsfel

RNA-nedbrytning och rester av föroreningar i vävnader,angående nedbrytning, låt oss först titta på varför RNA extraherat från odlade celler inte lätt bryts ned.Befintliga RNA-extraktionsreagenser innehåller alla komponenter som snabbt hämmar RNas.Tillsätt lysatet till de odlade cellerna och blanda det helt enkelt, alla celler kan blandas ordentligt med lysatet, och cellerna lyseras fullständigt.Efter att cellerna lyserats hämmar de aktiva ingredienserna i lysatet omedelbart det intracellulära RNaset, så att RNA:t förblir intakt.Det vill säga, eftersom de odlade cellerna lätt och fullständigt kommer i kontakt med lysatet, bryts deras RNA inte lätt ned;å andra sidan bryts RNA i vävnaden lätt ned eftersom cellerna i vävnaden inte är lätta att snabbt komma i kontakt med lysatet.på grund av tillräcklig kontakt.Så,förutsatt att det finns ett sätt att förvandla vävnaden till en enda cell samtidigt som den hämmar RNA-aktivitet, skulle problemet med nedbrytning kunna lösas helt.

Malning med flytande kväve är den mest effektiva metoden.Malningsmetoden med flytande kväve är dock mycket besvärlig, särskilt när antalet prover är stort.Detta gav upphov till det näst bästa: homogenisatorn.DehomogenisatorMetoden tar inte hänsyn till frågan om hur RNas-aktiviteten hämmas innan cellerna kommer i kontakt med lysatet, utan ber snarare att hastigheten för vävnadsavbrott är snabbare än den hastighet med vilken intracellulärt RNas bryter ned RN.

Effekten av elektrisk homogenisator är bättre,och effekten av glashomogenisator är dålig, men i allmänhet kan homogeniseringsmetoden inte förhindra nedbrytningsfenomenet.Därför, om extraktionen försämras, bör den ursprungliga elektriska homogenisatorn användas för malning med flytande kväve;originalglashomogenisatorn bör bytas till en elektrisk homogenisator eller direktmalas med flytande kväve.Problemet är nästan 100% genomförbart.lösa sig.

Problemet med föroreningsrester som påverkar efterföljande experiment har fler olika orsaker än nedbrytning, och lösningarna är på motsvarande sätt olika.Sammanfattningsvis,om det finns nedbrytning eller kvarvarande föroreningar i vävnaden måste extraktionsmetoden/reagenset för det specifika experimentmaterialet optimeras.Du behöver inte använda dina värdefulla prover för optimering: du kan köpa några smådjur som fisk/kyckling från marknaden, ta motsvarande del av materialet för RNA-extraktion och den andra delen för proteinextraktion – mala med mun, mage och tarmextrakt.

Mål-RNA:t för det extraherade RNA:t används för olika uppföljningsexperiment och dess kvalitetskrav är olika

cDNA-bibliotekskonstruktion kräver RNA-integritet utan rester av enzymreaktionshämmare;Northern kräver högre RNA-integritet och lägre krav på rester av enzymreaktionshämmare;RT-PCR kräver inte för hög RNA-integritet,men hämmar enzymreaktioner.Kraven på restprodukter är stränga.Ingången bestämmer utgången;varje gång målet är att få RNA med högsta renhet kommer det att kosta människorna och pengarna.

Samling/förvaring av prover

Faktorer som påverkar nedbrytningen Efter att provet lämnat den levande kroppen/eller den ursprungliga tillväxtmiljön kommer de endogena enzymerna i provet att börja bryta ned RNA,och nedbrytningshastigheten är relaterad till innehållet av endogena enzymer och temperatur.Traditionellt finns det bara två sätt att fullständigt hämma endogen enzymaktivitet: tillsätt lysat omedelbart och homogenisera grundligt och snabbt;skär i små bitar och frys omedelbart i flytande kväve.Båda tillvägagångssätten kräver snabb drift.Den senare är lämplig för alla prover, medan den förra endast är lämplig för vävnader med lågt innehåll av celler och endogena enzymer och lättare att homogenisera.Specifikt, växtvävnad, lever, tymus, bukspottkörteln, mjälte, hjärna, fett, muskelvävnad etc. fryses bäst med flytande kväve innan du fortsätter.

Fragmentering och homogenisering av prover

Faktorer som påverkar nedbrytning och utbyte Provfragmentering ärför grundlig homogenisering, vilket är för fullständig och fullständig frisättning av RNA.Celler kan homogeniseras direkt utan att brytas.Vävnader kan homogeniseras först efter att de har brutits.Jäst och bakterier måste brytas med motsvarande enzymer innan de kan homogeniseras.Vävnader med lägre endogent enzyminnehåll och lättare homogenisering kan krossas och homogeniseras på en gång i lysatet med en homogenisator;växtvävnad, lever, bräss, bukspottkörtel, mjälte, hjärna, fett, muskelvävnad och andra prover, De är antingen höga i endogena enzymer eller är inte lätta att homogenisera,så vävnadsavbrott och homogenisering måste utföras separat.Den mest pålitliga och mest produktiva metoden för fragmentering är malning med flytande kväve, och den mest pålitliga metoden för homogenisering är användningen av en elektrisk homogenisator.En speciell notering om malning med flytande kväve: provet får inte tinas under hela malningsprocessen, eftersom endogena enzymer är mer benägna att fungera när de fryses.

Val av lysat

Påverkar användarvänligheten och faktorerna för kvarvarande endogena föroreningar. De vanligen använda lyslösningarna kan nästan hämma aktiviteten av RNas.Därför är nyckeln med att välja en lyslösning att överväga i kombination med reningsmetoden.Det finns ett undantag:prover med högt endogent enzyminnehåll rekommenderas att använda ett lysat som innehåller fenol för att öka förmågan att inaktivera endogena enzymer.

Val av reningsmetod

Faktorer som påverkar kvarvarande endogena föroreningar, extraktionshastighet För rena prover såsom celler kan tillfredsställande resultat erhållas med nästan vilken reningsmetod som helst.Men för många andra prover, särskilt de med höga halter av föroreningar som växter, lever, bakterier etc., är valet av en lämplig reningsmetod avgörande.Kolonncentrifugalreningsmetoden har en snabb extraktionshastighet och kan effektivt ta bort orenheter som påverkar den efterföljande enzymatiska reaktionen av RNA, men den är dyr (Foregene kan erbjuda kostnadseffektiva kit, mer information klickahär);med ekonomiska och klassiska reningsmetoder, såsom LiCl-fällning, kan man också få tillfredsställande resultat, men drifttiden är lång..

"Tre discipliner och åtta uppmärksamhet" för RNA-extraktion

Disciplin 1:Sätt stopp för kontamineringen av exogena enzymer.

Anteckning 1:Bär strikt masker och handskar.

Anteckning 2:Centrifugerören, spetshuvudena, pipettstavarna, elektroforestankarna och experimentbänkarna som är involverade i experimentet bör kasseras noggrant.

Anmärkning 3:Reagenserna/lösningarna som ingår i experimentet, särskilt vatten, måste vara RNas-fria.

Disciplin 2:Blockera aktiviteten hos endogena enzymer

Anmärkning 4:Välj en lämplig homogeniseringsmetod.

Anmärkning 5:Välj ett lämpligt lysat.

Anmärkning 6:Kontrollera startmängden av provet.

Disciplin 3:Förtydliga ditt utvinningssyfte

Anmärkning 7:Med vilket lysatsystem som helst som närmar sig den maximala startmängden av prov, sjunker framgångsfrekvensen för extraktion kraftigt.

Anmärkning 8:Det enda ekonomiska kriteriet för framgångsrik RNA-extraktion är framgång i efterföljande experiment, inte avkastning.

Topp 10 källor till RNase-kontamination

1. Fingrar är den första källan till exogena enzymer, så handskar måste bäras och bytas ut ofta.Dessutom måste masker också bäras, eftersom andningen också är en viktig källa till enzymer.En ytterligare fördel med att bära en handskmask är att skydda försöksledaren.

2. Pipettspetsar, centrifugrör, pipetter – RNase kan inte inaktiveras enbart genom sterilisering, så pipettspetsar och centrifugrör bör behandlas med DEPC, även om de är märkta som DEPC-behandlade.Det är bäst att använda en specialpipett, torka av den med en bomullstuss med 75 % alkohol före användning, särskilt staven;dessutom, se till att inte använda en huvudborttagningsmedel.

3. Vattnet/bufferten måste vara fri från RNas-kontamination.

4. Åtminstone testbordet bör torkas rent med bomullstussar med 75 % alkohol.

5. Endogent RNas Alla vävnader innehåller endogena enzymer, så snabb frysning av vävnader med flytande kväve är det bästa sättet att minska nedbrytningen.Metoden för lagring/malning av flytande kväve är verkligen obekväm, men det är det enda sättet för vävnader med höga nivåer av endogena enzymer.

6. RNA-prov RNA-extraktionsprodukter kan innehålla spår av RNas-kontamination.

7. Plasmidextraktion Plasmidextraktion använder ofta RNAse för att bryta ner RNA, och det kvarvarande RNAse bör digereras med Proteinas K och extraheras med PCI.

8. RNA-lagring Även om det förvaras vid låg temperatur, kommer spårmängder av RNas att orsaka RNA-nedbrytning.Den bästa lösningen för långtidskonservering av RNA är en salt/alkoholsuspension, eftersom alkohol hämmar all enzymaktivitet vid låga temperaturer.

9. När katjoner (Ca, Mg) innehåller dessa joner kommer uppvärmning vid 80C i 5 minuter att göra att RNA spjälkas, så om RNA behöver värmas måste konserveringslösningen innehålla ett kelatbildande medel (1 mM natriumcitrat, pH 6,4).

10. Enzymer som används i efterföljande experiment kan vara kontaminerade av RNas.

10 tips för RNA-extraktion

1: Förhindra snabbt RNase-aktivitet.Prover fryses snabbt efter insamling och RNase inaktiveras genom snabb operation under lysering.

2: Välj en lämplig extraktionsmetod för vävnad med hög ribozymhalt, och fettvävnad är bäst att använda metoden som innehåller fenol.

3: Förutsägelsekvalitet kräver Northern, cDNA-bibliotekskonstruktion kräver hög integritet, och RT-PCR och RPA (Ribonuclease Protection Assay) kräver inte hög integritet.RT-PCR kräver hög renhet (enzyminhibitorrester).

4: Noggrann homogenisering är nyckeln till att förbättra utbytet och minska nedbrytningen.

5: Kontrollera integriteten för RNA-elektroforesdetektion, 28S: 18S = 2:1 är ett fullständigt tecken, 1:1 är också acceptabelt för de flesta experiment.

6: Borttagning av DNA för RT-PCR, arrayanalys Det är bäst att använda Dnase I för att ta bort DNA.

7: Minska kontamineringen av exogena enzymer – enzymer kan inte importeras utifrån.

8: Vid koncentrering av lågkoncentrationsnukleinsyra bör ett samfällningsreagens tillsättas.Men för att förhindra att co-precipitanten innehåller enzymer och DNA-kontamination.

9: Lös upp RNA:t, om nödvändigt, värm vid 65C i 5 minuter.

lämplig lagringsmetod

Den kan förvaras vid –20C under en kort tid och vid –80C under lång tid.Det första steget för att förbättra RNA-utbytet är att inse att RNA-innehållet i olika prover varierar mycket.Hög mängd (2-4 ug/mg) såsom lever, bukspottkörtel, hjärta, medel rik (0,05-2 ug/mg) såsom hjärna, embryo, njure, lunga, tymus, äggstock, låg förekomst (<0,05 ug/mg) mg) såsom urinblåsa, ben, fett.

1: Lysera celler för att frigöra RN – om RNA inte frisätts kommer utbytet att minska.Elektrisk homogenisering fungerar bättre än andra homogeniseringsmetoder, men kan också behöva kombineras med andra metoder, såsom flytande kvävemäskning, enzymatisk nedbrytning (Lysozym/Lyticase)

2: Optimering av extraktionsmetoden.De största problemen med fenolbaserade metoder är ofullständig stratifiering och partiell RNA-förlust (supernatanten kan inte avlägsnas helt).Ofullständig stratifiering beror på högt nukleinsyra- och proteininnehåll, vilket kan lösas genom att öka mängden lysat som används eller minska mängden prov.Ett steg av kloroformextraktion sattes till fettvävnaden.RNA-förlust kan minskas genom att pumpa tillbaka eller genom att ta bort det organiska skiktet följt av centrifugering.Det största problemet med kolonncentrifugeringsbaserade metoder är överskott av prov.

Klassiska extraktionstips

1. Fenolrening: Tillsätt en lika stor volym av 1:1 fenol/kloroform och blanda kraftigt i 1-2 minuter.Centrifugera vid hög hastighet i 2 minuter.Ta försiktigt bort supernatanten (80-90%).Kom aldrig till mellanskiktet.En lika stor volym av reaktionslösningen kan sättas till fenol/kloroform och supernatanten avlägsnas.De två supernatanterna kan blandas samman för nukleinsyrafällning för att förbättra utbytet.Var inte för försiktig när du blandar, och försök inte ta bort all supernatanten.

2. Tvätta med 70-80 % etanol: Under tvättningen måste nukleinsyran suspenderas för att säkerställa att restsaltet tvättas bort.Samtidigt, omedelbart efter att ha hällt av etanolen, centrifugera vid hög hastighet i några sekunder och avlägsna sedan resterande etanol med en pipett.Lös upp efter att ha stått i rumstemperatur i 5-10 minuter.

11. Utvinning av specialorganisationer

1. Fibrös vävnad: Nyckeln till RNA-extraktion från fibrös vävnad som hjärta/skelettmuskulatur är att helt störa vävnaden.Dessa vävnader har låg celltäthet, så mängden RNA per viktenhet vävnad är låg, och det är bäst att använda så mycket utgångsmängd som möjligt.Se till att slipa vävnaden noggrant under frysförhållanden.

2. Vävnader med hög protein/fetthalt: hjärnan/vegetabiliskt fettinnehåll är högt.Efter PCI-extraktion innehåller supernatanten vita flockar.Supernatanten måste återextraheras med kloroform.

3. Vävnader med högt innehåll av nukleinsyra/ribozym: mjälten/tymus har högt innehåll av nukleinsyra och ribozym.Att mala vävnad under frysningsförhållanden följt av snabb homogenisering kan effektivt inaktivera ribozymer.Men om lysatet är för trögflytande (på grund av högt nukleinsyrainnehåll), kommer PCI-extraktionen inte att kunna stratifiera effektivt;att lägga till mer lysat kan lösa problemet.Flera PCI-extraktioner kan ta bort mer kvarvarande DNA.Om en vit fällning bildas omedelbart efter tillsats av alkohol, tyder det på DNA-kontamination.Återextraktion med sur PCI efter upplösning kan avlägsna DNA-kontamination.

4. Växtvävnad: Växtvävnad är mer komplex än djurvävnad.I allmänhet mals växter under flytande kväve, så RNA-nedbrytning av endogena enzymer är ovanligt.Om nedbrytningsproblemet inte är löst är det nästan säkert orsakat av föroreningar som finns i provet.De föroreningar som finns i många växter kommer att leda till rester, och orsaken till rester är ofta för att dessa föroreningar har vissa likheter med RNA: du fäller ut och jag fäller ut, och du adsorberar och jag adsorberar.Dessa egenskaper bestämmer att de är mycket starka enzyminhibitorer.

För närvarande kan kommersiella RNA-extraktionsreagenser anpassas till nästan alla djurvävnader med små justeringar, men det finns få kommersiella RNA-extraktionsreagenser som kan vara lämpliga för de flesta växtvävnader.Lyckligtvis kan Foregene ge speciellaväxt-RNA-extraktionssatser, vi harPlant Total RNA-isoleringskit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Den senare är speciellt designad för växter med högt innehåll av polysackarider och polyfenoler.För RNA-extraktion är feedback från labbanvändare särskilt bra.

12. Effekten av provfrysning och upptining Det frusna provet kan vara större och det måste skäras innan det används för RNA-extraktion.Prover tenderar att smälta (eventuellt delvis) under skärning.Frysta prover kan behöva vägas före RNA-extraktion, och upptining kommer definitivt att ske under denna process.Ibland inträffar även upptining av provet under malningsprocessen med flytande kväve;eller så tillsätts det frusna provet direkt till lysatet utan malning med flytande kväve, och upptining kommer definitivt att ske innan den fullständiga homogeniseringen.Experiment har visat att frusen vävnad är mer benägen för RNA-nedbrytning under upptining än färsk vävnad.Den troliga orsaken: Frys-tina-processen stör strukturer i cellen, vilket gör det lättare för endogena enzymer att komma i direkt kontakt med RNA.

13. Bedömning av RNA-kvalitet Vanligtvis används elektrofores för att bedöma RNA:s integritet och A260/A280 används för att bedöma RNA:s renhet.I teorin har intakt RNA ett förhållande på 28S:18S = 2,7:1, och de flesta data betonar förhållandet 28S:18S = 2:1.Faktum är att nästan inget av RNA som extraherats från andra prover än celler är i ett 2:1-förhållande (detta erhölls med hjälp av Agilent Bioanalyzer).

Elektroforesresultaten av RNA påverkas av många faktorer, inklusive sekundär struktur, elektroforesförhållanden, provbelastning, mättnadsgrad av EB, etc. Använd nativ elektrofores för att detektera RNA och använd DNA-markör som kontroll.Om 28S vid 2 kb och 18S vid 0,9 kb är klara, och 28S: 18S > 1, kan integriteten uppfylla kraven för de flesta efterföljande experiment.

A260/A280 är en indikator som har orsakat mycket förvirring.Först och främst är det nödvändigt att klargöra den ursprungliga betydelsen av denna indikator för nukleinsyror: rent RNA, dess A260/280 = cirka 2,0.Rent RNA är "orsaken" och A260/A280 = 2 är "effekten".Nu använder alla A260/A280 som en "orsak" och tänker att "om A260/A280 = 2, så är RNA rent", vilket naturligtvis leder till förvirring.

Om du är intresserad kan du lägga till lite reagens som ofta används vid extraktion, såsom fenol, guanidin isotiocyanat, PEG, etc., till ditt RNA-prov och sedan mäta förhållandet A260/A280.Verkligheten är att många av de reagens som används för RNA-extraktion, såväl som många föroreningar i provet, absorberar runt A260 och A280, vilket påverkar A260/A280.

Det mest lärorika för närvarande är att skanna RNA-prover i intervallet 200-300 nm.Kurvan för rent RNA har följande egenskaper: kurvan är jämn, A230 och A260 är två böjningspunkter, A300 är nära 0, A260/A280 = cirka 2,0 och A260/A230 = cirka 2,0.Om skanningsdata inte är tillgängliga måste A260/A230-förhållandet också bestämmas, eftersom detta förhållande är mer känsligt för överföring av alla föroreningar som påverkar den enzymatiska reaktionen.Ta hänsyn till enhetens linjära räckvidd (0,1–0,5 för A260).

Det finns två andra användbara fenomen: förhållandet blir cirka 0,3 lägre när A260/A280 mäts i vatten;medan förhållandet uppmätt i 10 mM EDTA är ca 0,2 högre än det som uppmätts i 1 mM EDTA.

Relaterade produkter:

China Plant Total RNA Isolation Kit Tillverkare och leverantör |Foregene (foreivd.com)

RNA isoleringsserie Leverantörer och fabrik |Kinas RNA-isoleringsserietillverkare (foreivd.com)

RNA-isoleringsserie – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)