RT-qPCR-experiment inkluderar RNA-extraktion och kvalitetsbedömning, omvänd transkription och qPCR tre steg, varje steg har många försiktighetsåtgärder, kommer vi att presentera i detalj nedan.

Ⅰ.RNA kvalitetsbedömning

I RT-qPCR-experiment, efter avslutad RNA-extraktion, måste kvaliteten på RNA utvärderas, och uppföljningsexperimentet kan endast utföras efter att det är kvalificerat.Utvärderingsmetoder inkluderar spektrofotometer, Agilent gelelektrofores, Agilent 2100 analys, bland vilka den mest använda spektrofotometern och agarosgelelektroforesmetoddetektion.Det bör noteras att dessa två metoder måste användas tillsammans för att slutföra detektion och analys av RNA-koncentration, renhet och integritet, för att säkerställa kvaliteten på RNA.

Relaterat RNA-isoleringskit: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Mycket renat och högkvalitativt totalt RNA kan erhållas från olika odlade celler på 11 min.

Animal Total RNA Isolation Kit

Extrahera snabbt och effektivt totalt RNA av hög renhet och hög kvalitet från olika djurvävnader.

Spektrofotometer:

Spektrofotometern används huvudsakligen för att bestämma koncentrationen och renheten av RNA, men den kan inte detektera integriteten hos RNA och genomisk rest.Bland dem är A260/280 och A260/230 viktiga parametrar för detektion av RNA-renhet, och RNA-renhet kan detekteras enligt fluktuationen av deras värden:

1. 1.9< A260/280< 2.1, vilket indikerar att RNA-renheten är god;A260/280<1,9, vilket indikerar att det kan finnas en proteinrest i RNA;A260/280>2.1, vilket indikerar möjlig partiell nedbrytning av RNA, vilket ytterligare kan bekräftas genom agarosgelelektrofores.

2. 2.0< A260/230< 2.2, vilket indikerar att RNA-renheten är god;A260/230< 2,0, vilket indikerar att det kan finnas rester av organiska reagens i RNA, såsom fenoler, etanol eller sockerarter.

Agarosgelelektrofores:

Agarosgelelektroforesanalys kan analysera RNA-integritet, genom och proteinrester, men kan inte exakt kvantifiera koncentrationen av RNA eller detektera resterna av organiska reagenser.Ta eukaryota RNA-mallar till exempel:

1. RNA:t utsattes för agarosgelelektrofores.Om det bara fanns tre enstaka band av 28sRNA, 18sRNA och 5.8sRNA på gelkartan, indikerar det att det extraherade RNA:t är intakt.Om det finns ett dragningsfenomen indikerar det partiell nedbrytning av RNA.

2. Om det finns ett enda ljust band mellan limhålet och 28sRNA-bandet kan det finnas genomisk DNA-rester.

3. Om det uppstår band i limhålet tyder det på att det kan finnas rester av protein och andra makromolekylära ämnen.

Ⅱ. Omvänd transkription

Efter att RNA-extraktionen är klar måste den vändas till cDNA för efterföljande experiment, så vändningssteget är viktigt.Omvänd transkription kommer att introduceras från valet av omvänt transkriptas och primer:

Val av omvänt transkriptas:

De typiska omvända transkriptaserna inkluderar AMV RTase och MMLV RTase.RNase H av AMV RTase har stark aktivitet, kort synteslängd, låg syntesmängd och god termisk stabilitet (42 ~ 55 ℃).RNase H-aktiviteten för MMLV RTase är svag, synteslängden är lång, syntesmängden är hög och den termiska stabiliteten är dålig (37 ~ 42 ℃).

Eftersom RNase H-enzym har funktionen att bryta ned RNA-mall, bör MMLV med svag RNas H-aktivitet företrädesvis väljas under omvänd transkription, och efter senare genteknik har den termiska stabiliteten för MMLV nått ett kvalitativt språng.Tar ForegeneForeasy omvänt transkriptas (M-MLV för omvänd transkription) som ett exempel är det ett nytt omvänt transkriptas uttryckt i E. coli-konstruerade bakterier med hjälp av genetisk rekombinationsteknologi.Det är ett rekombinant DNA-polymeras som syntetiserar en komplementär DNA-sträng från enkelsträngat RNA, DNA eller en RNA:DNA-hybrid.Den har ingen RNas H-aktivitet, stark stabilitet, stark RNA-affinitet och hög detektionskänslighet.

 

Foreasy omvänt transkriptas (M-MLV för omvänd transkription)

Val av primer:

Generellt faller RT-primrar in i tre kategorier: oligo-dT, slumpmässiga primrar och genspecifika primrar.Välj lämpliga primers för användning enligt olika experimentella krav.

1. Om mallen är av eukaryot ursprung och det sena cDNA används för rutinmässig PCR-amplifiering, rekommenderas Oligo (dT).Om det efterföljande experimentet endast används för qPCR, rekommenderas Oligo (dT) att blandas med slumpmässiga primers för att förbättra effektiviteten av omvänd transkription.

2. Om mallen är från prokaryoter bör slumpmässiga primrar eller genspecifika primrar väljas för omvänd transkription.

Ⅲ.qPCR

Fluorescenskvantifiering utarbetas huvudsakligen från valet av kvantitativa metoder, primerdesignprinciper, ROX-val, reaktionssystemkonfiguration och inställning av reaktionsförhållanden, etc.

Urval av kvantitativa metoder:

Kvantitativa metoder är indelade i relativa kvantitativa metoder och absoluta kvantitativa metoder.Relativ kvantifiering kan användas för att detektera effekten av vissa behandlingsmetoder på genuttryck, detektera skillnaden i genuttryck vid olika tidpunkter och jämföra skillnaden i genuttryck i olika vävnader.Absolut kvantifiering kan detektera mängden nukleinsyra i viruset och så vidare.När vi gör experiment måste vi välja lämpliga kvantitativa metoder enligt våra egna experiment.

Primer designprinciper:

Utformningen av primer för qPCR är direkt relaterad till amplifieringseffektiviteten och produktspecificiteten.Därför är korrekt design av bra primers det första steget i framgångsrik qPCR.Vid design av primer bör följande principer uppmärksammas när man uppfyller principen för konventionell primerdesign:

1. Längden på målfragmentet kontrolleras mellan 100 och 300 bp;

2. Cross-exon design för att undvika påverkan av genomiskt DNA;

3. De designade primrarna måste testas för amplifieringseffektivitet, och endast när amplifieringseffektiviteten når standarden (90-110%) kan de användas för kvantitativa experiment;

4. Primerkoncentrationen är vanligtvis optimerad mellan 0,1 uM och 1,0 uM.

Urval avROX:

I processen med kvantitativ reaktion kan ROX justera den optiska vägskillnaden, pipetteringsfelet eller volymskillnaden som orsakas av förångning och kondensation enhetligt, vilket förbättrar repeterbarheten av resultaten.Det bör dock noteras att valet av ROX är relaterat till instrumentet.Om qPCR-instrumentet har funktionen att automatiskt korrigera skillnaden mellan hålen, behöver det inte lägga till ROX;annars måste den lägga till ROX-korrigering.Små partners för att köpa reagens måste vara enligt det instrument som används för att välja rätt ROX, undvika senare misstag.

Förberedelse av reaktionssystem:

Reaktionsvolymer på 20 ul och 50 ul är föredragna.Följande saker bör uppmärksammas när systemet utformas:

1. Reaktionssystemet behöver förberedas genom ventilation i den ultrarena arbetsbänken, nya ddH₂O används för varje experiment;

2. Varje experiment måste förbereda NTC för att verifiera om det finns föroreningar i systemet, och varje par av primers måste göra NTC när systemet förbereds;

3. För att detektera om det finns gDNA-rester i RNA-mallen kan NRT förberedas för varje prov för detektion;

4. När du förbereder systemet rekommenderas det att göra minst 3 tekniska repetitioner för ett prov;

5. När mallen är cDNA, rekommenderas att späda 5-10 gånger för att minska hämningseffekten av omvänt transkriptionssystem på qPCR-experiment.Det är bättre att utforska mallens kvantitet efter gradient, så att CT-värdet faller mellan 20-30;

6. Bestäm det erforderliga antalet reaktioner, öka med 5-10 % på basis av antalet reaktioner och beräkna volymkonfigurationstalet;

7, systemet förbereds med hjälp av förblandningsprincipen, blandas efter centrifugering och säkerställ inga bubblor;

8, Så långt det är möjligt att välja stödjande förbrukningsvaror.

Relaterat RT-qPCR-kit