1. Detektera absorbansen av RNA-lösning
Absorbans vid 280, 320, 230 och 260 nm representerar värdena för nukleinsyra, bakgrund (lösningens grumlighet), saltkoncentration respektive organiskt material såsom protein.Titta i allmänhet bara på OD260/OD280 (Ratio, R).När 1,8 ~ 2,0, tror vi att kontaminering av protein eller annat organiskt material i RNA kan tolereras, men det bör noteras att när Tris används som buffert för att detektera absorbansen, kan R-värdet vara större än 2 (i allmänhet bör det vara <2,2).När R<1,8 är föroreningen av protein eller annat organiskt material i lösningen mer uppenbart, och RNA:ts öde kan bestämmas efter behoven.När R>2,2 betyder det att RNA har hydrolyserats till en enkel nukleinsyra.
2. Elektroforetiskt mönster av RNA
I allmänhet används denaturerande gel för RNA-elektrofores, men om det bara är för att detektera kvaliteten på RNA är denaturerande gel inte nödvändigt, och vanlig agarosgel kan användas.Syftet med elektrofores är att detektera integriteten hos 28S- och 18S-banden och deras förhållande, eller integriteten hos mRNA-utstryk.I allmänhet, om 28S- och 18S-banden är ljusa, klara och skarpa (med hänvisning till att kanterna på banden är tydliga), och ljusstyrkan för 28S är mer än dubbelt så hög som för 18S-bandet, anser vi att kvaliteten på RNA är bra.
Ovanstående är de två metoder som vi vanligtvis använder, men ingen av dessa två metoder kan tydligt berätta för oss om det finns kvarvarande RNas i RNA-lösningen.Om det finns en mycket liten mängd RNas i lösningen är det svårt för oss att upptäcka det med ovanstående metod, men de flesta av de efterföljande enzymatiska reaktionerna utförs vid över 37 grader och under lång tid.På så sätt, om det finns en mycket liten mängd RNas i RNA-lösningen, kommer det att finnas en mycket lämplig miljö och tid att spela sin roll i de efterföljande experimenten, och naturligtvis kommer experimentet att vara kallt vid denna tidpunkt.Nedan introducerar vi en metod som kan bekräfta om det finns kvarvarande RNas i RNA-lösningen.
3. Värmekonserveringstest
Beroende på provkoncentrationen, dra två stycken 1000 ng RNA från RNA-lösningen och tillsätt det till ett 0,5 ml centrifugrör, och komplettera det med pH 7,0 Tris-buffert till en total volym av 10 ul, och försegla sedan locket på röret.Lägg en av dem i ett vattenbad med konstant temperatur vid 70°C och håll det varmt i 1 timme.Den andra delen förvarades i ett -20°C kylskåp i 1 timme.När tiden är ute, ta bort de två proverna för elektrofores.Efter att elektroforesen är klar, jämför de elektroforetiska banden för de två.Om banden av de två är konsekventa eller inte har någon signifikant skillnad (naturligtvis uppfyller deras band också villkoren i metod 2), betyder det att det inte finns någon kvarvarande RNas-kontamination i RNA-lösningen, och kvaliteten på RNA:t är mycket bra.Tvärtom, om provet inkuberat vid 70°C visar uppenbar nedbrytning, indikerar det att det finns RNas-kontamination i RNA-lösningen.
2 Experimentella metoder och tekniker för RNA-extraktion
De problem vi ofta stöter på när vi extraherar RNA är: (1) RNA-utbytet är lågt;(2) RNA har allvarlig saltförorening;(3) RNA har allvarliga organiska lösningsmedelsföroreningar;(4) provnedbrytning och andra problem
1. Vanligt använda total-RNA-extraktionsreagenser
Guanidinisotiocyanatmetoden och Trizolmetoden är de mest använda metoderna för extraktion av totalt RNA från djurvävnader och djurceller.Den är särskilt lämplig för små prover och vävnader som är särskilt svåra att extrahera, såsom extraktion av totalt RNA från kaninhud och djurbindväv;dessutom kan Trizol, som ett lysreagens för allmänt ändamål, också användas för extraktion av växtvävnader, bakterier, svampar och andra vävnader.För växtvävnader som innehåller polysackarider och polyfenoler, såsom camellia oleifera, teblad, raps, etc., kan CTAB-metoden även användas för att extrahera totalt RNA.
Som en konventionell metod är dubbelkolumnmetoden också mycket populär på grund av dess normala temperaturdrift, inget behov av att lägga till RNas och säkerhet - inga kloroform, fenoler och andra organiska reagenser för extraktion.(rekommenderade produkter )
2. Extraktion av totalt RNA från djurvävnader
(1) Försök att välja färsk vävnad, om den inte är färsk (helst inom tre månader - 80 ℃ kylskåp eller fryst i flytande kväve. När du skär vävnad, skär inte direkt i rumstemperatur, se till att Lägg den på islådan, försök att undvika upprepad frysning och upptining.
(2) Använd en ren sax och pincett för att klippa en liten bit vävnad, försök att klippa den centrala delen av vävnaden när du klipper provet, eller klipp först den stora biten av vävnaden från mitten och klipp sedan provet vid det färska snittet.Den borttagna vävnaden ska vara helt strimlad, lägg den strimlade vävnaden i ett EP-rör utan RNas, tillsätt lysatet, den strimlade vävnaden ska vara helt exponerad för lysatet och förbered för homogenisering.
(3) För normala vävnader, välj vävnader i mungbönastorlek (30-60 mg) för homogenisering.Om vävnaderna innehåller en stor mängd protein, fett eller täta fibrösa vävnader som lever, öka eller minska på lämpligt sätt mängden avskurna vävnader (valfritt) Välj 10~20 mg).
(4) Om fiskmuskler, räkkött, maneter och andra vävnader med hög vattenhalt extraheras, bör provvolymen ökas på lämpligt sätt (rekommenderad 100-200 mg).
(5) Om förhållandena tillåter kan djurvävnaden extraheras direkt efter att ha homogeniserats med en högpassagevävnadshomogenisator, om det inte finns någon sådan utrustning.
(6) Det RNA som erhålls efter den slutliga extraktionen måste omedelbart placeras på islådan för att minska nedbrytningen av RNA.
3. Djurcell-RNA-extraktion
(1) Suspensionsceller: centrifugera direkt och kassera mediet, tvätta med steril PBS 1-2 gånger, suspendera sedan med en lämplig mängd PBS och tillsätt sedan lysat för lysering.Tillsätt inte lysatet direkt till de utfällda cellerna efter att vätskan har kasserats helt.Detta kommer att få histonpaketet som frigörs efter de lyserade cellerna på det yttre lagret att fästa vid utsidan av de utfällda cellerna, vilket begränsar kontakten mellan cellerna inuti pelleten och lysatet.resulterande i ofullständig cellys och reducerat RNA-utbyte.
(2) Celler som är halvvidhäftande eller inte tätt vidhäftande: Efter att ha kasserat mediet, tvätta med PBS i 1-2 gånger, absorbera sedan en lämplig mängd PBS direkt och blås odlingsskålen med en pipett eller pistol för att blåsa av cellerna och överför dem till RNA-fria celler.Tillsätt lysatet till enzymets EP-rör för extraktion.
(3) Vidhäftande celler: måste först smältas med trypsin, sedan samlas upp i RNas-fria EP-rör, centrifugeras för att avlägsna supernatanten, tvättas 1-2 gånger med PBS för att avlägsna överskott av trypsin och återsuspenderas med en lämplig mängd PBS Fortsätt sedan till extraktionssteget.
4. Växt-RNA-extraktion
Växtvävnader är rika på fenoliska föreningar, eller rika på polysackarider, eller innehåller några oidentifierade sekundära metaboliter, eller har hög aktivitet av RNas.Dessa ämnen är tätt kombinerade med RNA efter cellys för att bilda olösliga komplex eller kolloidala fällningar, som är svåra att avlägsna.När vi extraherar växtvävnad måste vi därför välja ett kit för växter.Lysatet i kitet kan effektivt lösa problemen med enkel oxidation av polyfenoler och separation av polysackaridföreningar och nukleinsyror.
(För extraktion av polysackaridpolyfenol växt-RNA, rekommenderade produkter:
(1) Skalet, fruktköttet, fröna, löv etc. av växten bör malas helt i en mortel.Under malningsprocessen bör flytande kväve fyllas på i tid för att undvika att provet smälter.Det malda provet bör snabbt tillsättas till lysatet och skakas för att undvika RNA-nedbrytning.
(2) För fiberrika prover som ris och veteblad bör mängden extraktion reduceras på lämpligt sätt, annars kommer vävnadsmalningen och lyseringen inte att vara fullständig, vilket resulterar i ett lågt utbyte av extraherat RNA.
(3) För växtvävnader med högt vatteninnehåll, såsom granatäpplefrukt, vattenmelonfrukt, persikafrukt, etc., bör provstorleken ökas på lämpligt sätt (100–200 mg är valfritt).
(4) Växtvävnader, såsom växtblad, rhizomer, hårda frukter och andra material rekommenderas i allmänhet att använda flytande kväve för att noggrant mortla ingredienserna i en mortel och sedan gå vidare till extraktionssteget.Konventionella vävnadshomogenisatorer kanske inte är effektiva för att homogenisera växtvävnader och rekommenderas i allmänhet inte.
5. Försiktighetsåtgärder för RNA-extraktion
(1) Vävnadsprover bör vara så färska som möjligt för att undvika upprepad frysning och upptining.
(2) Vävnaden bör vara helt mald under extraktion, och mängden vävnad bör inte vara för liten, än mindre för mycket.
(3) Tillräcklig inkubationstid bör ges efter tillsats av lysatet för att fullständigt lysera provet.
(4) När man använder Trizol-metoden för extraktion är principen att absorbera supernatanten efter stratifiering "föredrar att andas in mindre än andas in mer", och får inte extrahera till mellanskiktet, annars kommer det att orsaka allvarlig genomisk DNA-kontamination.
(5) Vid tvätt bör tvättvätskan infiltrera helt runt rörväggen för att säkerställa noggrann tvättning.
(6) För kolonnextraktionsmetoden bör adsorptionskolonnen, förutom att lossa kolonnen efter tvätt, även placeras i en ultraren bänk och blåsas i 5-10 minuter för att helt avdunsta det organiska lösningsmedlet till torrhet.
(7) Vid den sista elueringen av kolonnmetoden, efter tillsats av DEPC-vatten, bör det inkuberas i 3-5 minuter, eller så bör DEPC-vattnet värmas till 60°C i förväg för att öka elueringsutbytet.I den traditionella Trizol-klyvnings- och isopropanolutfällningsmetoden löses det slutliga RNA:t i DEPC-vatten, så en lämplig tid bör ges för upplösning, och botten av centrifugröret ska kontinuerligt blåsas med en pipettspets.
3 Ttre orsaker och lösningar för låg RNA-koncentration/dålig kvalitet
1. Utbytet är för lågt
Det extraherade provet är för lågt, den totala mängden är otillräcklig eller det extraherade provet är för mycket och lyseringen är inte fullständig;vävnaden eller cellerna av lämplig kvalitet bör användas för extraktion, förbehandlingen av provet måste göras väl och lyseringen bör vara tillräcklig.
2. Genomrester
Vid extraktion med Trizol-metoden, när supernatanten sugs in i mellanskiktet efter skiktning, kommer allvarlig genomkontamination att orsakas;extra försiktighet bör iakttas vid skiktning för att undvika att suga in i mellanskiktet.Om kolonnmetoden används för extraktion kan ett kit innehållande DNas I väljas för extraktion.Nukleinsyran som adsorberas på membranet spjälkas direkt med DNas I, vilket avsevärt kan reducera DNA-rester.
3. RNA-nedbrytning
Det kan vara nedbrytningen av det extraherade provet i sig, eller nedbrytningen som orsakas under extraktionsprocessen;så långt det är möjligt bör färska prover användas för RNA-extraktion, och de insamlade proverna bör förvaras i flytande kväve eller -80°C kylskåp i tid, och upprepad frysning och upptining bör undvikas.RNase/DNas-fria spetsar, centrifugrör och andra material bör användas i RNA-extraktionsprocessen.Extraktionsprocessen bör vara så snabb som möjligt.Det extraherade RNA:t bör placeras på en islåda och förvaras vid -80 i tid.Om det extraherade RNA:t behöver detekteras med gelelektrofores, bör elektrofores utföras omedelbart efter extraktion, och elektroforesbufferten ska ersättas med en nypreparerad.
4. Salt och organiska lösningsmedelsrester
Extraktionsreagensen innehåller fenol- och guanidinsalter, och tvättlösningen innehåller etanol.Under extraktionsprocessen absorberades inte lysatet fullständigt och kasserades, och tvättlösningen torkades inte helt.Kvarvarande salter och organiska lösningsmedel är skadliga för efterföljande omvänd transkription och PCR.Olika grader av hämning, så vävnadslysatet bör avlägsnas helt under extraktionsprocessen, och tvättningen bör vara tillräcklig så att rörets omgivande väggar kan tvättas.Dessutom töms röret och blåser är ett nödvändigt steg, vilket ytterligare kommer att minska resterna av organiskt material.
För mer information om RNA-extraktion, följ vår hemsida:
www.foreivd.com för mer information.
Posttid: 2022-01-01
