Fluorescenskvantitativ PCR (även känd som TaqMan PCR, nedan kallad FQ-PCR) är en ny kvantitativ nukleinsyrateknologi utvecklad av PE (Perkin Elmer) i USA 1995. Denna teknologi är baserad på konventionell PCR genom tillsats av fluorescensmärkta prober.Jämfört med flexibel PCR har FQ-PCR många fördelar för att realisera sin kvantitativa funktion.Denna artikel avser att kortfattat beskriva egenskaperna, principerna, metoderna och tillämpningarna av tekniken.

1 Funktioner

FQ-PCR har inte bara den höga känsligheten för vanlig PCR, utan också på grund av tillämpningen av fluorescerande prober, kan den direkt detektera förändringen av fluorescerande signal under PCR-amplifiering genom det fotoelektriska ledningssystemet för att erhålla kvantitativa resultat, som övervinner många brister med konventionell PCR, så den har också den höga specificiteten av DNA-teknikens höga specificitet och hybridiseringsteknik.

Till exempel måste allmänna PCR-produkter observeras genom agarosgelelektrofores och etidiumbromidfärgning med ultraviolett ljus eller genom polyakrylamidgelelektrofores och silverfärgning.Detta kräver inte bara flera instrument, utan tar också tid och ansträngning.De fläckar som används Etidiumbromid är skadliga för människokroppen, och dessa komplicerade experimentella procedurer ger möjligheter till föroreningar och falska positiva resultat.FQ-PCR behöver dock bara öppna locket en gång under provladdning, och den efterföljande processen är helt sluten rördrift, vilket inte kräver PCR-efterbearbetning, vilket undviker många nackdelar med konventionella PCR-operationer.Experimentet använder i allmänhet ABI7100 PCR-termisk cykler som utvecklats av PE-företaget.

Instrumentet har följande egenskaper: ① Bred användning: Det kan användas för DNA- och RNA PCR-produktkvantifiering, genuttrycksforskning, patogendetektion och optimering av PCR-förhållanden.② Unik kvantitativ princip: Med användning av fluorescensmärkta prober kommer mängden fluorescens att ackumuleras med PCR-cykeln efter laserexcitering, för att uppnå syftet med kvantifiering.③ Hög arbetseffektivitet: Inbyggd 9600 PCR termisk cykler, datorstyrd 1 till 2 timmar för att slutföra amplifieringen och kvantifieringen av 96 prover automatiskt och synkront.④ Inget behov av gelelektrofores: Inget behov av att späda ut och elektrofores provet, använd bara en speciell sond för att detektera direkt i reaktionsröret.⑤Inga föroreningar i rörledningen: Det unika helt slutna reaktionsröret och det fotoelektriska ledningssystemet har antagits, så det finns ingen anledning att oroa sig för föroreningar.⑥Resultaten är reproducerbara: det kvantitativa dynamiska området är upp till fem storleksordningar.Därför, sedan denna teknik utvecklades framgångsrikt, har den värderats av många vetenskapliga forskare och har tillämpats inom många områden.

2 Principer och metoder

Arbetsprincipen för FQ-PCR är att använda 5′→3′ exonukleasaktiviteten hos Taq-enzym för att lägga till en fluorescensmärkt sond till PCR-reaktionssystemet.Sonden kan specifikt hybridisera med DNA-mallen som finns i primersekvensen.5'-änden av sonden är märkt med fluorescensemissionsgenen FAM (6-karboxifluorescein, fluorescensemissionstopp vid 518nm), och 3'-änden är märkt med den fluorescenssläckande gruppen TAMRA (6-karboxytetrametylfluorescens vid 5-karboxitetrametylfluorescens, 5-2' fluorescrodamin, 5'2). rensning av sonden fosforyleras för att förhindra att sonden förlängs under PCR-amplifiering.När sonden förblir intakt undertrycker quenchergruppen fluorescensemissionen från den emitterande gruppen.När den emitterande gruppen är separerad från den släckande gruppen upphävs hämningen, och den optiska densiteten vid 518 nm ökar och detekteras av fluorescensdetektionssystemet. I renatureringsfasen hybridiserar sonden med mall-DNA:t och Taq-enzymet i förlängningsfasen rör sig längs DNA-mallen med förlängningen av primern.När sonden skärs av släpps den släckande effekten och den fluorescerande signalen släpps.Varje gång mallen kopieras skärs en sond av, åtföljd av frigörandet av en fluorescerande signal.Eftersom det finns ett en-till-en-samband mellan antalet frisatta fluoroforer och antalet PCR-produkter, kan denna teknik användas för att exakt kvantifiera mallen.Det experimentella instrumentet använder i allmänhet ABI7100 PCR-termisk cykler som utvecklats av PE-företaget, och andra termiska cykler kan också användas.Om reaktionssystemet ABI7700 används för experimentet kan de kvantitativa resultaten ges direkt genom datoranalys efter att reaktionen är avslutad.Om du använder andra termiska cykler måste du använda en fluorescensdetektor för att mäta fluorescenssignalen i reaktionsröret samtidigt för att beräkna RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ representerar förhållandet mellan luminescensintensiteten för den fluorescerande emissionsgruppen i provröret och luminescensintensiteten för den släckande gruppen, RQ- representerar förhållandet mellan de två i det tomma röret, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) representerar mängden av dataförändringar under fluorescensprocessen som kan erhållas efter PCRanti-processen.På grund av införandet av fluorescerande prober förbättras specificiteten för experimentet avsevärt.Sondens design bör generellt uppfylla följande villkor: ①Längden på sonden bör vara cirka 20-40 baser för att säkerställa bindningsspecificiteten.② Innehållet av GC-baser är mellan 40 % och 60 % för att undvika duplicering av enstaka nukleotidsekvenser.③ Undvik hybridisering eller överlappning med primers.④ Stabiliteten för bindningen mellan proben och mallen är större än stabiliteten för bindningen mellan primern och mallen, så Tm-värdet för sonden bör vara minst 5°C högre än Tm-värdet för primern.Dessutom har koncentrationen av sonden, homologin mellan sonden och mallsekvensen och avståndet mellan sonden och primern alla inverkan på de experimentella resultaten.

Relaterade produkter:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(Med gDNas)(Super Premix för första-strängs cDNA-syntes från lncRNA) Tillverkare och leverantör |Foregene (foreivd.com)

Kina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Tillverkare och leverantör |Foregene (foreivd.com)