Alla pratar om principen för qRT-PCR-experiment, primerdesign, resultattolkning etc., men jag tycker att jag ska dela med dig av den experimentella driften av qRT-PCR.Det är litet, men det handlar om resultat.
Innan vi gör qRT-PCR måste vi ha en klar förståelse för vårt eget RNA och operationsmetoder.Våra ansträngningar är trots allt inriktade på att få resultat, snarare än att bara öva.Så innan vi gör qRT-PCR måste vi bestämma följande problem (av vilka några endast är tillämpliga på SYBR).
1 Är du säker på att ditt RNA inte är nedbrutet?
NanoDrop 2000 kan bara detektera koncentrationen och renheten av RNA, men kan inte detektera integriteten av RNA.
RNA-värdet (RNA Intesity Number) kan återspegla RNA:ts integritet, som detekteras av Agilent 2100 Bioanalyzer-systemet.
Fig. Schematiskt diagram över RIN-värden för olika RNA-prover (eukaryoter)
Laboratorier har dock i allmänhet inte Agilent 2100 Bioanalyzer.I det här fallet kan vi detektera genom formaldehydgel, men kravet på den totala mängden RNA är högt, så den snabbaste metoden är att använda vanlig gelelektrofores.Det krävs att det är i en nukleasfri miljö, så det är nödvändigt att skölja elektroforestanken, solflaskan, gelfästet och kammen med DEPC-vatten.Agarosen är också nukleasfri (så länge den är nyöppnad), och Loading Buffer bör vara nyöppnad så mycket som möjligt, med 1,2 % gel.
Observera att gelén måste vara helt upplöst, annars kommer den att orsaka inhomogena band, som visas i prov 9 i figuren.Om spänningen är för hög eller körs för länge kommer det att generera värme och orsaka RNA-nedbrytning, så spänningen och tiden bör kontrolleras rimligt.Dessutom kan gelkörning också ytterligare avgöra om det finns DNA-rester i provet, och observera om det finns ett stort antal kvarhållna band i dispenseringsbrunnen.
Figur.Gelelektroforesdetektion av RNA
2 Är du säker på koncentrationen av ditt cDNA?
Erfarenheterna från storebröderna i laboratoriet är att cDNA från 20 ul-systemet som erhålls vid varje inversion späds direkt 20X, medan postdoktorala systrarna späds 10X.Jag brukar vara beroende av situationen.Eftersom kvaliteten på det RNA som nämns av varje person är olika, är nivån av reversering också olika, och reverseringstekniken kanske inte är stabil.
Så varje gång jag får det omvända cDNA:t kommer jag först att späda ut det cirka 3 gånger och sedan använda hushållningsgenen för att göra RT-PCR, antalet cykler är i allmänhet 25 cykler, för att identifiera den specifika koncentrationen och sedan bestämma den slutliga utspädningsfaktorn.
3 Är du säker på att dina primers är lätta att använda?
Det kan passera smältkurvan för qRT-PCR, men detta kostar fortfarande pengar.För laboratorier utan mycket pengar, när de får mycket primers, kan de använda vanlig RT-PCR för att se om det är ett enda band och identifiera primrarnas specificitet.Om laboratoriet inte har ont om pengar kan specificiteten för alla primers identifieras en gång genom smältkurvan.
4 Är du säker på att dina experimentförhållanden är lämpliga?
SYBR bör skyddas från starkt ljus, så försök att stänga av taklampan när du lägger till SYBR-reagens och behöver bara använda svagt ljus för att slutföra det.
Förvara SYBR vid 4°C.När den används, vänd försiktigt upp och ner för att blanda väl för att undvika skum, och vortexa inte kraftigt.
Vissa yngre systrar gillar att rita märken på PCR-kortet av rädsla för att blanda ihop proverna, vilket är fel.Eftersom dina markörer mycket sannolikt kommer att påverka insamlingen av fluorescerande signaler, rekommenderar jag generellt att juniorer använder experimentella anteckningsböcker för att hjälpa till med minnet, som visas nedan.
Figur.qRT-PCR provladdningsdiagram
5 Är du säker på att du gör det rätt?
Var noga med att bära handskar, bära handskar, bära handskar och säga viktiga saker tre gånger.
För att minska exponeringen av SYBR för ljus vill jag personligen lägga till en mall först, som visas i figuren nedan.Enligt erfarenhet kommer tillägget av en liten mängd mall sannolikt att orsaka provtagningsfel.Därför, för att minimera felet som orsakas av att lägga till en liten mängd mall, dubblar jag vanligtvis provet igen och dubblar mängden när jag lägger till provet för att minska mängden H2O2 som tillsätts.
Figur.Schematiskt diagram över qRT-PCR-laddning
Konfigurera sedan qRT-PCR-systemet enligt följande.
Figur.qRT-PCR-system förberedelsediagram
OBS: Konfigurationsprocessen måste göras på is.
Efter att ha tillsatt provet, klistra in den genomskinliga förseglingsfilmen.Försök att inte röra vid ytan på den genomskinliga förseglingsfilmen med händerna, bara arbeta från utrymmet på båda sidor av filmen.Eftersom fingeravtryck också kan påverka insamlingen av fluorescerande signaler.Använd sedan en centrifug för att snabbt centrifugera i 10 s med låg hastighet för att förhindra att provet hänger på väggen.
Relaterade produkter:
Posttid: 2023-apr-28
