RT-qPCR är molekylärbiologins grundläggande experiment, och alla måste vara bekanta med det.Den innehåller huvudsakligen tre steg: RNA-extraktion, omvänd transkription till cDNA och fluorescerande kvantitativ PCR i realtid.Det hjälper inte, vad är det som händer?Det är troligt att det finns ett problem medexperimentet med omvänd transkription!Även om det verkar som att experimentet med omvänd transkription bara behöver lägga till RNA, dNTP, primers ochOmvänt transkriptastill centrifugröret och blanda väl, men i själva driftprocessen är det fortfarande många detaljer som måste uppmärksammas.Låt oss lära oss om det!

Hur bedömer man kvaliteten på RNA?
För att få cDNA är kvaliteten på RNA avgörande!RNA-kvalitet kan detekteras huvudsakligen från två aspekter:
(1) RNA-integritet:RNA-integritet kan verifieras genom agarosgelelektrofores. Om man tar eukaryoter som ett exempel har det fullständiga totala RNA tre tydliga band, molekylvikterna från stor till liten är 28S, 18S och 5S, och 28S är dubbelt så ljus som 18S;om tre band kan ses, men bandtypen är suddig eller Diffusion betyder att RNA:t bryts ned delvis.Vid denna tidpunkt, vänligen utför den omvända transkriptionsreaktionen omedelbart och öka mallinmatningen på lämpligt sätt;om bara ett band med en liten molekylvikt eller inget band kan ses, har RNA:t brutits ned fullständigt och måste extraheras på nytt.Agilent 2100 indikerar integriteten av RNA med toppdiagram och RIN-värde.Om nukleinsyran är intakt är baslinjen för elektroferogrammet platt;om nukleinsyran är allvarligt nedbruten är baslinjen ojämn och fler nedbrytningstoppar uppträder;värdet på RIN återspeglar RNA:ts integritet, inom intervallet 0-10, ju högre värdet är, desto bättre är kvaliteten på RNA:t.Tja, ju högre grad av fullständighet.
(2) Renhet av RNA:Förhållandet OD260/280 kan detekteras med UV-spektrofotometri.Om förhållandet OD260/280 är mellan 1,9 och 2,1 är renheten mycket bra.
Återstående genomiskt DNA kan leda till felaktiga kvantitativa resultat
När RNA extraheras kan det RNA vi får blandas med genomiskt DNA (gDNA) som inte har rensats.Därför kommer cDNA efter omvänd transkription också att blandas medgDNA.Under nedströmsqPCRreaktion,cDNAoch gDNA kan amplifieras samtidigt, vilket resulterar i ett relativt litet CT-värde, så resultaten kan vara partiska.
Så vad ska vi göra i den här situationen?Föregeneföreslår:
(1) Utför genomrengöring på det omvända RNA:t, som kan avlägsnas genom kolonnextraktion under RNA-extraktion;
(2) Behandla det extraherade RNA:t med DNasI , men avsluta det med EDTA;
av omvänd transkriptionsreagensmed genomrensningsmoduler;

Hur väljer man primers för omvänd transkription?
Omvänd transkriptionsprimrar påverkar också resultatet av den omvända transkriptionsreaktionen.Du kan välja slumpmässiga primers, Oligo dT eller genspecifika primers för omvänd transkription enligt de specifika omständigheterna för experimentet:
(1) Specifika avskrifter: genspecifika primrar rekommenderas;
(2) Långa fragmentavskrifter: Oligo dT/genspecifika primers rekommenderas;
(3) Inre fragment av transkript med långa segment: genspecifika primrar/slumpmässiga primrar/slumpmässiga primrar + Oligo dT.Om det efterföljande qPCR-experimentet utförs kan Oligo dT inte användas ensamt, eftersom användning av enbart Oligo dT kan orsaka 3′-ändsbias, vilket leder till felaktiga qPCR-experimentresultat;
(4) miRNA: Stam-loop primers eller tailing primers kan användas.

Hur många gånger ska omvänd transkriptionsproduktens cDNA spädas ut för kvantifiering?
Efter att ha erhållit cDNA för den omvända transkriptionsprodukten är det mycket viktigt hur många gånger cDNA:t ska spädas ut för qPCR-experiment.Om cDNA-koncentrationen är för hög eller för låg kan amplifieringseffektiviteten påverkas.Kan cDNA-koncentrationen mätas, och hur ska det göras?
(1) cDNA-koncentrationen av den omvända transkriptionsprodukten kan inte mätas, eftersom den omvända transkriptionsprodukten förutom cDNA-produkten också innehåller omvänd transkriptionsrestbuffert, omvänt transkriptas, primers, etc., vilket kommer att interferera med koncentrationsmätningsresultaten och orsakar OD260/280, OD300/DNA reflekterar därför inte c.Vid den här tiden kommer några vänner att säga, då kommer jag att mäta koncentrationen efter rening;Här vill Foregene påminna om att cDNA:t inte rekommenderas att renas, eftersom längden på cDNA som erhålls genom omkastningen är annorlunda, och det korta cDNA:t kommer att gå förlorat i reningen.
(2) Så vad ska man göra?Före qPCR-experimentet kan utspädningsgradienten för cDNA:t bestämmas genom förexperimentet.Till exempel: använd cDNA-stamlösning, 10-faldig spädning och 100-faldig spädning som mallar för qPCR-experiment, och välj utspädningsfaktorn med ett CT-värde i intervallet 18-28.

Hur ska miRNA omvänt transkriberas?
miRNA är en enkelsträngad liten molekyl-RNA med en storlek på cirka 22 nt som inte kodar för protein.På grund av dess korta längd är konventionell qPCR-metod svår att direkt kvantifiera den, så det är ofta nödvändigt att utöka miRNA;de vanligaste metoderna för omvänd transkription för miRNA inkluderar stam-loop-metoden och tailing-metoden.
Stam-loop-metoden är att förlänga miRNA genom att lägga till stam-loop-primers.Denna detektionsmetod har högre känslighet och specificitet, men detektionsgenomströmningen är låg.En omvänd transkription kan bara detektera ett miRNA och en intern referens;svanstillsatsmetoden består av två Den fullbordas av en gemensam verkan av två enzymer, som är PolyA-polymeras och omvänt transkriptas.PolyA-polymeras är ansvarigt för att lägga till PolyA-svansar till miRNA för att öka dess längd, och omvänt transkriptas utför omvänd transkriptionsreaktion.Denna metod har hög detektionsgenomströmning och kan detektera flera miRNA och interna referenser i en omvänd transkription, men känsligheten och specificiteten är låg i stam-loop-metoden.