Realtids-PCR, även känd som kvantitativ PCR eller qPCR, är en metod för realtidsövervakning och analys av PCR-förstärkningsprodukter.
Eftersom kvantitativ PCR har fördelarna med enkel operation, snabb och bekväm, hög känslighet, god repeterbarhet och låg kontamineringshastighet, används den i stor utsträckning inom medicinsk testning, bedömning av läkemedelseffektivitet, genuttrycksforskning, transgen forskning, gendetektering, patogendetektion, djur- och växtdetektion., mattestning och andra områden.
Därför, oavsett om du är engagerad i grundforskning inom biovetenskap, eller anställda på läkemedelsföretag, djuruppfödningsföretag, livsmedelsföretag, eller till och med anställda på in- och utfartsinspektioner och karantänsbyråer, miljöövervakningsavdelningar, sjukhus och andra enheter, kommer du att bli mer eller mindre exponerad för Eller så behöver du känna till kunskapen om att bemästra kvantitativ PCR.

Principen för realtids-PCR

Realtids-PCR är en metod där fluorescerande ämnen läggs till PCR-reaktionssystemet, och fluorescenssignalintensiteten i processen för PCR-reaktion övervakas i realtid av ett kvantitativt PCR-instrument, och slutligen analyseras och bearbetas experimentdata.

【Amplifieringskurva】är kurvan som beskriver den dynamiska processen för PCR.Amplifieringskurvan för PCR är faktiskt inte en standardexponentiell kurva, utan en sigmoidkurva.

[Plattformsfas för amplifieringskurva]Med ökningen av antalet PCR-cykler, inaktiveringen av DNA-polymeras, utarmningen av dNTP:er och primrar, och inhiberingen av syntesreaktionen av reaktionsbiprodukten pyrofosfat, etc., expanderar PCR inte alltid exponentiellt., och kommer så småningom att gå in på en platå.

[Exponentiell tillväxtregion för amplifieringskurva]Även om platåfasen varierar mycket, i en viss region av den exponentiella tillväxtregionen av amplifieringskurvan, är repeterbarheten mycket god, vilket är mycket viktigt för kvantitativ analys av PCR.

[Tröskelvärde och Ct-värde]Vi ställer in gränsvärdet för fluorescensdetektion vid lämplig position i det exponentiella tillväxtområdet för amplifieringskurvan, nämligen tröskelvärdet (Threshold).Skärningspunkten mellan tröskelvärdet och förstärkningskurvan är Ct-värdet, det vill säga Ct-värdet avser antalet cykler (Threshold Cycle) när tröskelvärdet nås.

Grafen nedan visar tydligt sambandet mellan tröskellinje och amplifieringskurva, tröskelvärde och Ct-värde.

【Hur kvantifierar man?】

Det har bevisats av matematisk teori att Ct-värdet har ett omvänt linjärt samband med logaritmen för antalet initiala mallar.Realtids-PCR övervakar PCR-förstärkningsprodukter i realtid och kvantifierar dem under den exponentiella förstärkningsfasen.

För varje PCR-cykel ökade DNA exponentiellt med 2 gånger och nådde snart en platå.

Om vi ​​antar att mängden start-DNA är A₀ , efter n cykler kan den teoretiska mängden DNA-produkt uttryckas som:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Sedan, ju mer den initiala DNA-mängden Ao är, desto snabbare når mängden av den amplifierade produkten detektionsvärdet An, och antalet cykler när man når An är Ct-värdet.Det vill säga, ju mer den initiala DNA-mängden Ao är, desto tidigare toppar amplifieringskurvan, och på motsvarande sätt är det erforderliga antalet cykler n mindre.

Vi utför gradientutspädning av standarden för känd koncentration och använder den som en mall för realtids-PCR, och en serie amplifieringskurvor kommer att erhållas med lika intervall i ordningen för start-DNA-mängden från mer till mindre.Enligt det linjära förhållandet mellan Ct-värdet och logaritmen för antalet startmallar, a[standardkurva] kan skapas.

Genom att ersätta Ct-värdet för provet med okänd koncentration i standardkurvan kan den initiala mallmängden av provet med okänd koncentration erhållas, vilket är den kvantitativa principen för realtids-PCR.

Detektionsmetod för realtids-PCR

Realtids-PCR detekterar PCR-amplifieringsprodukter genom att detektera fluorescensintensiteten i reaktionssystemet.

Principen för fluorescerande färginbäddningsmetod】

Fluorescerande färgämnen, såsom TB Green®, kan icke-specifikt binda till dubbelsträngat DNA i PCR-system och fluorescera vid bindning.

Fluorescensintensiteten i reaktionssystemet ökade exponentiellt med ökningen av PCR-cykler.Genom att detektera fluorescensintensiteten kan mängden DNA-amplifiering i reaktionssystemet övervakas i realtid, och sedan kan mängden av startmallen i provet uppskattas omvänt.

【Principen för fluorescerande sondmetod】

fluorescerande sondär en nukleinsyrasekvens med en fluorescerande grupp vid 5'-änden och en släckande grupp vid 3'-änden, som specifikt kan binda till mallen.När sonden är intakt släcks den fluorescens som emitteras av fluoroforen av den släckande gruppen och kan inte fluorescera.När sonden sönderdelas kommer den fluorescerande substansen att dissociera och avge fluorescens.

En fluorescerande sond tillsätts till PCR-reaktionslösningen.Under hybridiseringsprocessen kommer den fluorescerande sonden att binda till mallens specifika position.Under förlängningsprocessen kan 5′→3′ exonukleasaktiviteten hos PCR-enzymet sönderdela den fluorescerande sonden hybridiserad med mallen, och den fluorescerande substansen dissocieras för att emittera fluorescens.Genom att detektera fluorescensintensiteten hos sonden i reaktionssystemet kan syftet med att övervaka amplifieringsmängden av PCR-produkten uppnås.

【Val av fluorescensdetektionsmetod】

Om den används för att särskilja sekvenser med hög homologi och utföra multiplex PCR-detektion såsom SNP-typningsanalys, är den fluorescerande sondmetoden oersättlig.
För andra realtids-PCR-experiment kan en enkel, lätt och billig fluorescerande chimärmetod användas.

sonder Stark specificitet, kapabel till multiplex PCR

Brist

Höga specificitetskrav för förstärkning;

multiplex PCR kan inte utföras Behov av att designa specifika prober, hög kostnad;

ibland är probdesign svårt

Relaterade produkter: