RNase är ett känsligt ord som många elever som ofta genomför RNA-extraktionsexperiment inte vill höra.Fullt beväpnad bröts RNA:t som slutligen extraherades med de mycket giftiga reagensen fenol och kloroform ned.Jag är inte försonad!!!Idag, låt oss ta en titt på ursprunget till den berömda Rnase.

Ribonukleas (RNase), eller RNase, är ett nukleas som kan hydrolysera RNA till små molekyler.RNas, som ett litet molekylprotein, är ovanligt stabilt .Konventionell högtemperatur- och högtrycksångsterilisering och proteininhibitorer kan inte helt inaktivera den.Stabiliteten av RNase kommer huvudsakligen från disulfidbindningarna i strukturen.Till exempel har det vanligt använda RNaset från bovin pankreas endast 124 aminosyror, men innehåller 4 disulfidbindningar.Svavelbindning och disulfidbindning ger RNas utmärkt termisk stabilitet.Dessutom har rnas en relativt liten molekylvikt och kan snabbt återställa sin ursprungliga konformation i många fall.

Förutom att vara extremt stabil,RNaser är allestädes närvarande i laboratoriet .RNas är en biologisk försvarsmekanism.För en cell är exogent RNA ofta dödligt.Jämfört med exogent DNA är exogent RNA ofta farligare.RNA transkriberas och översätts glatt, så nästan alla organismer har utvecklat RNaser för att försvara sig mot invasionen av exogent RNA.Därför utstrålar de bakterieceller som odlas i laboratoriet och du som utvinner RNA aromen av RNas.Människokroppsvätskor (saliv, tårar, etc.) innehåller en stor mängd RNas, så gråt inte när RNA bryts ned.Ju mer du gråter, desto värre blir RNA-nedbrytningen!!Syster Daiyu är inte lämplig för RNA-extraktion!

Dessutom innehåller din ömtåliga hud också mycket RNase, och de markörer, pipetter, kylskåpsdörrar och dörrhandtag som har berörts av huden innehåller också RNase.

Med så mycket vandring, låt oss ta en titt på hur man hanterar RNaser.

Det första som alla tänker på när man tar bort RNA ärDEPC(dietylpyrokarbonat).DEPC denaturerar huvudsakligen proteinet genom att kombinera med imidazolringen i den aktiva RNase-gruppen histidin, och därigenom hämma enzymets aktivitet.0,1 % DEPC kan ha en bättre borttagningseffekt på RNAse, men vi måste vara uppmärksamma på att DEPC är ett känt cancerframkallande ämne, så särskild uppmärksamhet bör ägnas när du använder det.

För RNase måste vi utgå från två aspekter,den första är att hämma aktiviteten av endogent RNas

Konventionella RNA-extraktionsreagenser som guanidinisotiocyanat och DTT som finns i Trizol kan öppna disulfidbindningen av RNas, men det finns fortfarande några RNaser, särskilt i vävnadsprover, så var uppmärksam på låg temperatur.

1.Doppa omedelbart vävnadsprovet i flytande kväve efter att det tagits ut, eller i en kommersiell RNA-konserveringslösning.

2.Efter att ha extraherat RNA från cellprovet, tillsätt det till lyslösningen och lysera det på islådan

3. Det är bäst att använda flytande kväve för malning när vävnadsprover homogeniseras.När du använder en elektrisk homogenisator utan flytande kväve, var uppmärksam på att homogenatadaptern är helt förkyld.

Det andra är exogent DNas

1.Var fullt beväpnad, bär en labbrock, bär en mask och se till att ha på dig ett par nya handskar (var inte så sparsam!! Det ska noteras att Trizol är superfrätande, och det är också väldigt starkt genom handskar, så droppa inte på händerna).

2.Alla använda pipettspetsar, EP-rör, PCR-rör och annan utrustning måste de-RNase-behandlas.Den kan blötläggas i 0,1 % DEPC och sedan trycksättas under högt tryck.Var uppmärksam på operationen i ett dragskåp.Lokala tyranner kan direkt köpa förbrukningsvaror för att ta bort enzymer.

PS: Låt mig berätta en lat metod.Även om hög temperatur och högt tryck inte helt kan ta bort RNase, kommer det att ta bort en stor del av det.2 gånger hög temperatur och högt tryck har en god effekt, och extraktion av RNA har liten effekt.

3.Alkohol kan denaturera proteiner,så RNA-extraktionstabellen kan torkas av med 75 % alkohol , och handskar kan också sprayas med alkohol.

4.Den slutliga RNA-lösningen och centrifugröret bör också de-RNas-behandlas.DEPC-vatten är en vanlig RNA-upplösningslösning.Låt oss prata om den korrekta beredningsmetoden för DEPC-vatten (kom ihåg att packa om den kommersiella DEPC-enheten när du köper den)

Tillsätt DEPC till ultrarent vatten vid 1:1000, skaka väl, låt stå över natten vid 37°C och sterilisera vid 121°C under hög temperatur och högt tryck i 15 minuter.DEPC-vatten kan förvaras vid -20°C i 1 ml alikvoter.

Slutligen, för att sammanfatta: låg temperatur är nyckeln, förbrukningsvaror hanteras väl, fullt beväpnade och mindre prat!

Tja, det var allt för dagens strategi.Jag önskar dig all RNA-koncentration och renhet du nämnde.Båda A260/A280 är 2.0!!!

Naturligtvis, om du använder enrumstemperaturdrift RNA-extraktionssats, kanske du inte stöter på ovanstående problem.

Drift vid rumstemperatur, utan tillsats av DNas, extraherar totalt RNA från celler på 11 minuter och extraherar totalt RNA från djurvävnader eller växter på 30 minuter.

För provprov, kontakta:overseas@foregene.com

Relaterade produkter:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/