Tips för att förbättra limåtervinningen

1. Öka provbelastningen under elektrofores.

2. Använd nyberedd elektroforesbuffert.

3. När du skär lim, försök att bara skära limmet med remsor för att minska volymen av limskärning: du behöver inte lim med få ändamålsfragment, annars kommer det att påverka återhämtningshastigheten.

4. Efter att ha smält två eller flera limbitar, använd en tub oavsett hur stor volymen är och överför den till samma kolonn.

5. Lösningen som tillsätts i solen kan vara lite mer, vilket är mer gynnsamt för bindningen av DNA till membranet, men överstiger i allmänhet inte 750 ul.

6. Nyckeln till gelåtervinning är att binda DNA till kolonnen genom saltkoncentrationen, surheten (laddningen) och hydrofobiciteten hos lösningen i kolonnen.Därför, om pH för elektroforesbufferten är för högt, kan 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) tillsättas till solen;För att bättre kunna fånga upp DNA-molekyler på membranet kan 30 % isopropanol tillsättas för att värma upp vätskan efter att limmet har lösts upp.

7. Innan du tillsätter eluenten, låt kolonnen stå i rumstemperatur i några minuter (cirka 10 minuter) för att helt avdunsta etanolen.

8. Tillsätt slutligen mindre elueringsmedel för att minimera återvinningsvolymen.I allmänhet används 30-50μl elueringsmedel för eluering (inte för lite, annars kommer det inte att kunna väta membranet, vilket inte bidrar till eluering);elueringsdropparna är i mitten av membranet, för att helt eluera DNA bundet till membranet.

9. Efter tillsats av eluenten kan den elueras i ett vattenbad på 55 grader i 5 minuter eller placeras i ett vattenbad på 50 grader i mer än 10 minuter, eller förseglas med en parafilm vid 4 grader över natten, och sedan centrifugeras för återhämtning nästa dag, effekten är god.

10. Tillsätt det centrifugerade eluatet tillbaka till adsorptionskolonnen och centrifugera igen.

Detaljerade metoder och procedurer för PCR-produktåterställning

1. Vanlig gummiåtervinning

Om du vill återställa limmet är det bäst att använda ett kit, som är bekvämt och har en något högre återvinningsgrad.Om du verkligen behöver återställa den manuellt, kan du lägga till 3 gånger volymen TE efter att ha klippt limet.Efter smältning i vattenbad extraheras fenol, fenol/kloroform rent och etanol fälls ut.Det är allt.

2. DNA-återvinning från geler med låg smältpunkt

Rening av DNA-fragment Tillsätt TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) lika med volymen av gelén och placera i ett 65°C vattenbad i 5 minuter för att lösa gelén helt.

Efter att den bringats till rumstemperatur tillsattes en lika stor mängd fenol (mättad med TE, TE förseglades i det övre skiktet och det undre skiktet av fenol togs bort) och blandningen blandades försiktigt (ingen blandning krävdes) och centrifugerades vid 12 000 rpm i 3 minuter.Upprepa 1-2 gånger.

Ta supernatanten, tillsätt 0,1 volym 3mol/L natriumacetat (pH 5,2) och 2,5 gånger volymen absolut etanol för att utföra etanolfällning.Lös upp det renade DNA:t med en lämplig mängd TE, mät innehållet och förbered för användning (det kan användas för målgenstrukturanalys, sondberedning, etc.).

3. PCR-återvinning med god amplifieringsspecificitet

Om specificiteten för PCR-amplifiering är god är det bara en enkel rening och återvinning av PCR-produkten.Du kan tillsätta 50 ug/ml proteinas K till PCR-produkten, 37 grader i 1 timme, extrahera en gång med fenol/kloroform, extrahera en gång med kloroform och tillsätt 0,1 volym av supernatanten.Natriumacetatet utvanns genom utfällning med 2,5 volymer absolut etanol.

Relaterade produkter:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/