一、Öka reaktionssystemets känslighet：

1. Isolera högkvalitativt RNA:

Framgångsrik cDNA-syntes kommer från högkvalitativt RNA.RNA av hög kvalitet bör åtminstone vara fullängd och fritt från omvända transkriptashämmare som EDTA eller SDS.Kvaliteten på RNA bestämmer den maximala mängden sekvensinformation du kan transkribera till cDNA.En vanlig RNA-reningsmetod är en enstegsmetod som använder guanidin isotiocyanat/syrafenol.För att förhindra kontaminering av spårmängder av RNas måste RNA isolerat från RNas-rika prover (som bukspottkörteln) lagras i formaldehyd för att bevara högkvalitativt RNA, särskilt för långtidsförvaring.RNA extraherat från råttlever bröts i princip ned efter att ha lagrats i vatten i en vecka, medan RNA extraherat från råttmjälte förblev stabil efter att ha lagrats i vatten i 3 år.Dessutom är transkript längre än 4 kb mer känsliga för nedbrytning av spår-RNaser än små transkript.För att öka stabiliteten hos lagrade RNA-prover kan RNA lösas i avjoniserad formamid och förvaras vid -70°C.Formamid som används för att bevara RNA måste vara fri från RNA-nedbrytande skräp.RNA från bukspottkörteln kan bevaras i formamid i minst ett år.När du förbereder dig för att använda RNA kan du använda följande metod för att fälla ut RNA: tillsätt NaCl till 0,2M och 4 gånger volymen etanol, placera i rumstemperatur i 3-5 minuter och centrifugera vid 10 000×g i 5 minuter.

2. Använd RNaseH-inaktivt (RNaseH-) omvänt transkriptas：

RNas-inhibitorer tillsätts ofta för omvända transkriptionsreaktioner för att öka längden och utbytet av cDNA-syntes.RNas-hämmare bör tillsättas under syntesreaktionen av den första strängen i närvaro av en buffert och ett reduktionsmedel (såsom DTT), eftersom processen före cDNA-syntes denaturerar inhibitorn och frisätter därigenom bundet RNas som kan bryta ned RNA.Protein RNas-hämmare förhindrar endast nedbrytningen av RNA av RNas A, B, C och förhindrar inte RNas på huden, så var försiktig så att du inte introducerar RNas från dina fingrar trots användningen av dessa hämmare.

Omvänt transkriptas katalyserar omvandlingen av RNA till cDNA.Både M-MLV och AMV har endogen RNaseH-aktivitet förutom sin egen polymerasaktivitet.RNaseH-aktivitet och polymerasaktivitet konkurrerar med varandra om hybridsträngen som bildas mellan RNA-mallen och DNA-primern eller cDNA-förlängningssträngen och bryter ner RNA-strängen i RNA:DNA-komplexet.RNA-mallen som bryts ned av RNaseH-aktivitet kan inte längre tjäna som ett effektivt substrat för cDNA-syntes, vilket minskar utbytet och längden av cDNA-syntesen.Därför skulle det vara fördelaktigt att eliminera eller kraftigt minska RNaseH-aktiviteten av omvänt transkriptas.

SuperScript Ⅱ omvänt transkriptas, RNaseH-MMLV omvänt transkriptas och thermoScript omvänt transkriptas, RNaseH-AMV, kan erhålla mer mängd och mer fullängds cDNA än MMLV och AMV.RT-PCR-känslighet kommer att påverkas av mängden cDNA-syntes.ThermoScript är mycket känsligare än AMV.Storleken på RT-PCR-produkter begränsas av förmågan hos omvänt transkriptas att syntetisera cDNA, speciellt vid kloning av större cDNA.Jämfört med MMLV ökade SuperScripⅡ signifikant utbytet av långa RT-PCR-produkter.RNaseH-omvänt transkriptas har också ökad termostabilitet, så reaktionen kan utföras vid temperaturer högre än de normala 37-42°C.Under de föreslagna syntesbetingelserna, använd oligo(dT)-primer och 10 μCi av [α-P]dCTP.Det totala utbytet av den första strängen beräknades med användning av TCA-utfällningsmetoden.Fullängds-cDNA analyserades med användning av storlekssorterade band som skars ut och räknades på en alkalisk agarosgel.

3. Höj inkubationstemperaturen för omvänd transkription:

En högre inkubationstemperatur hjälper till att öppna RNA:s sekundära struktur, vilket ökar utbytet av reaktionen.För de flesta RNA-mallar kommer inkubering av RNA och primrar vid 65°C utan buffert eller salt, följt av snabb kylning på is, att eliminera de flesta sekundära strukturer och tillåta primers att binda.Vissa mallar har dock fortfarande sekundära strukturer, även efter värmedenaturering.Amplifiering av dessa svåra mallar kan utföras med hjälp av ThermoScript omvänt transkriptas och placera den omvända transkriptionsreaktionen vid en högre temperatur för att förbättra amplifieringen.Högre inkubationstemperaturer kan också öka specificiteten, särskilt när genspecifika primrar (GSP) används för cDNA-syntes (se kapitel 3).Om du använder GSP, se till att Tm för primrarna är samma som den förväntade inkubationstemperaturen.Använd inte oligo(dT) och slumpmässiga primrar över 60°C.Slumpmässiga primrar kräver inkubation vid 25°C i 10 minuter innan de ökar till 60°C.Förutom att använda en högre temperatur för omvänd transkription kan specificiteten också förbättras genom att direkt överföra RNA/primerblandningen från 65°C denatureringstemperaturen till inkubationstemperaturen för omvänd transkription och tillsätta en förvärmd 2x reaktionsblandning (cDNA varmstartsyntes).Detta tillvägagångssätt hjälper till att förhindra den intermolekylära basparningen som sker vid lägre temperaturer.Den multipla temperaturväxlingen som krävs för RT-PCR kan förenklas genom att använda en termisk cykler.

Det värmestabila polymeraset fungerar som ett DNA-polymeras i närvaro av Mg2+ och som ett RNA-polymeras i närvaro av Mn2+.Den kan hållas varm vid en maxtemperatur på 65°C.Närvaron av Mn2+ under PCR minskar emellertid troheten, vilket gör Tth-polymeras mindre lämpligt för högprecisionsamplifiering, såsom kloning av cDNA.Dessutom har Tth låg omvänd transkriptionseffektivitet, vilket minskar känsligheten, och eftersom omvänd transkription och PCR kan utföras med ett enda enzym, kan kontrollreaktioner utan omvänd transkription inte användas för att jämföra cDNA-amplifieringsprodukter med kontaminerande genomiskt DNA.Amplifieringsprodukterna separerades.

4. Tillsatser som främjar omvänd transkription:

Tillsatser inklusive glycerol och DMSO tillsätts till syntesreaktionen för första strängen, vilket kan minska stabiliteten hos nukleinsyrans dubbelsträng och lösa upp den sekundära strukturen av RNA.Upp till 20 % glycerol eller 10 % DMSO kan tillsättas utan att SuperScript II- eller MMLV-aktiviteten påverkas.AMV kan också tolerera upp till 20 % glycerol utan att aktiviteten försvinner.För att maximera känsligheten för RT-PCR i SuperScriptⅡ omvänd transkriptionsreaktion kan 10 % glycerol tillsättas och inkuberas vid 45°C.Om 1/10 av den omvända transkriptionsreaktionsprodukten tillsätts till PCR, är koncentrationen av glycerol i amplifieringsreaktionen 0,4 %, vilket inte är tillräckligt för att hämma PCR.

5. RNaseH-behandling:

Behandling av cDNA-syntesreaktioner med RNaseH före PCR kan öka känsligheten.För vissa mallar är det tänkt att RNA i cDNA-syntesreaktionen förhindrar bindningen av amplifieringsprodukter, i vilket fall RNaseH-behandling kan öka känsligheten.I allmänhet är RNaseH-behandling nödvändig när man amplifierar längre cDNA-målmallar i full längd, såsom tuberös scherosis II med låg kopia.För denna svåra mall förbättrade RNaseH-behandling signalen som produceras av SuperScript II eller AMV-syntetiserat cDNA.För de flesta RT-PCR-reaktioner är RNaseH-behandling valfri, eftersom PCR-denatureringssteget vid 95°C i allmänhet hydrolyserar RNA:t i RNA:DNA-komplexet.

6. Förbättring av detektionsmetod för små RNA:

RT-PCR är särskilt utmanande när endast små mängder RNA är tillgängliga.Glykogen tillsatt som bärare under RNA-isolering hjälper till att öka utbytet av små prover.RNasfritt glykogen kan tillsättas samtidigt som Trizol tillsätts.Glykogen är vattenlösligt och kan hållas i vattenfasen med RNA för att underlätta efterföljande utfällning.För prover mindre än 50 mg vävnad eller 106 odlade celler är den rekommenderade koncentrationen av RNasfritt glykogen 250 μg/ml.

Att lägga till acetylerad BSA till den omvända transkriptionsreaktionen med SuperScript II kan öka känsligheten, och för små mängder RNA kan en minskning av mängden SuperScript II och tillsats av 40 enheter RNaseOut nukleashämmare öka detektionsnivån.Om glykogen används i RNA-isoleringsprocessen, rekommenderas det fortfarande att lägga till BSA eller RNas-hämmare när SuperScript II används för omvänd transkriptionsreaktion.

二、Öka RT-PCR-specificiteten

1. CND-asyntes:

Första-strängs cDNA-syntes kan initieras med hjälp av tre olika metoder, vars relativa specificitet påverkar mängden och typen av syntetiserat cDNA.

Den slumpmässiga primermetoden var den minst specifika av de tre metoderna.Primers hybridiserar vid flera ställen genom hela transkriptet och genererar korta cDNA:n av partiell längd.Denna metod används ofta för att erhålla 5'-ändsekvenser och för att erhålla cDNA från RNA-mallar med regioner med sekundär struktur eller med termineringsställen som inte kan replikeras med omvänt transkriptas.För att erhålla det längsta cDNA:t måste förhållandet mellan primers och RNA i varje RNA-prov bestämmas empiriskt.Startkoncentrationen av slumpmässiga primrar varierade från 50 till 250 ng per 20 μl reaktion.Eftersom cDNA syntetiserat från totalt RNA med användning av slumpmässiga primrar primärt är ribosomalt RNA, väljs i allmänhet poly(A)+RNA som mall.

Oligo(dT)-primrar är mer specifika än slumpmässiga primrar.Det hybridiserar till poly(A)-svansen som finns i 3′-änden av de flesta eukaryota mRNA.Eftersom poly(A)+-RNA är ungefär 1 % till 2 % av totalt RNA, är mängden och komplexiteten av cDNA mycket mindre än med slumpmässiga primrar.På grund av dess höga specificitet kräver oligo(dT) i allmänhet inte optimering av förhållandet mellan RNA och primrar och poly(A)+-selektion.Det rekommenderas att använda 0,5 μg oligo(dT) per 20 μl reaktionssystem.oligo(dT)12-18 är lämplig för de flesta RT-PCR.ThermoScript RT-PCR-systemet erbjuder oligo(dT)20 på grund av dess bättre termiska stabilitet för högre inkubationstemperaturer.

Genspecifika primrar (GSP) är de mest specifika primrarna för det omvända transkriptionssteget.GSP är en antisens-oligonukleotid som specifikt kan hybridisera till RNA-målsekvensen, till skillnad från slumpmässiga primrar eller oligo(dT), som hybridiserar till alla RNA.Samma regler som används för att designa PCR-primers gäller för designen av GSP i omvända transkriptionsreaktioner.GSP:n kan vara samma sekvens som amplifieringsprimern som hybridiserar till den 3'-änden av mRNA:t, eller GSP:n kan utformas för att hybridisera nedströms om den omvända amplifieringsprimern.För vissa amplifierade försökspersoner behöver mer än en antisens-primer utformas för framgångsrik RT-PCR eftersom den sekundära strukturen av mål-RNA:t kan förhindra primerbindning.Det rekommenderas att använda 1 pmol antisense GSP i en 20 μl första-strängssyntesreaktion.

2. Höj inkubationstemperaturen för omvänd transkription:

För att dra full nytta av den fulla fördelen med GSP-specificitet bör ett omvänt transkriptas med högre termostabilitet användas.Termostabila omvända transkriptaser kan inkuberas vid högre temperaturer för att öka reaktionsstringensen.Till exempel, om en GSP hybridiserar vid 55°C, kommer specificiteten hos GSP inte att utnyttjas fullt ut om AMV eller M-MLV används för omvänd transkription vid en låg stringens på 37°C.SuperScript II och ThermoScript kan dock reageras vid 50°C eller högre, vilket kommer att eliminera icke-specifika produkter som genereras vid lägre temperaturer.För maximal specificitet kan RNA/primerblandningen överföras direkt från 65°C denatureringstemperaturen till inkubationstemperaturen för omvänd transkription och läggas till en förvärmd 2x reaktionsblandning (cDNA-syntes varmstart).Detta hjälper till att förhindra intermolekylär basparning vid låga temperaturer.De multipla temperaturövergångarna som krävs för RT-PCR kan förenklas genom att använda en termisk cykler.

3. Minskar genomisk DNA-kontamination:

En potentiell svårighet man stöter på med RT-PCR är kontamineringen av genomiskt DNA i RNA:t.Att använda en bra RNA-isoleringsmetod, såsom Trizol Reagent, kommer att minska mängden genomiskt DNA som kontaminerar RNA-preparatet.För att undvika produkter som härrör från genomiskt DNA kan RNA behandlas med amplifieringsgrad DNas I för att avlägsna kontaminerande DNA före omvänd transkription.DNas I-digestionen avslutades genom att inkubera proverna i 2,0 mM EDTA under 10 minuter vid 65°C.EDTA kan kelera magnesiumjoner, vilket förhindrar magnesiumjonberoende RNA-hydrolys vid höga temperaturer.

För att separera amplifierat cDNA från kontaminerande genomiska DNA-amplifieringsprodukter kan primrar designas som varje hybridiserar till separata exoner.PCR-produkter härledda från cDNA kommer att vara kortare än de som härrör från kontaminerat genomiskt DNA.Dessutom utfördes ett kontrollexperiment utan omvänd transkription på varje RNA-mall för att bestämma om ett givet fragment härrörde från genomiskt DNA eller cDNA.PCR-produkten som erhålls utan omvänd transkription härrör från genomet.