COVID-19 är en infektionssjukdom som orsakas av allvarligt akut respiratoriskt syndrom Coronavirus typ 2. När en person är smittad är de vanligaste symtomen feber, hosta och andnöd.

Proverna som används för testning kan samlas in med nasofaryngeala pinnar eller orofaryngeala pinnar.

Vad är PCR?

Standardmetoden för detektion av coronavirus är polymeraskedjereaktion, PCR.Detta är en metod som används mycket inom molekylärbiologi.Den kan snabbt kopiera miljoner till miljarder specifika DNA-fragment.

Det nya coronaviruset innehåller ett mycket långt enkelsträngat RNA-genom.För att upptäcka dessa virus genom PCR måste RNA-molekyler omvandlas till sina komplementära DNA-sekvenser genom omvänt transkriptas, och sedan kan det nysyntetiserade DNA:t amplifieras med standard-PCR-förfaranden, som är allmänt känt som RT-PCR.

RT-PCR-process

RNA-extraktion

För att utföra denna metod bör viralt RNA i princip extraheras.En mängd olika RNA-reningssatser kan användas för bekväm, snabb och effektiv separation.

För att extrahera viralt RNA med ett kommersiellt kit, tillsätt först provet till ett mikrocentrifugrör och blanda det sedan med lysbufferten.Denna buffert är mycket denaturerad och består vanligtvis av fenol och guanidin isotiocyanat.Dessutom är RNas-hämmare vanligtvis närvarande i lysbufferten för att säkerställa isolering av intakt viralt RNA.

Efter att ha tillsatt lyseringsbufferten, vortexa blandningsröret med puls och inkubera vid rumstemperatur.Viruset lyseras sedan under starkt denaturerande betingelser som tillhandahålls av lysbufferten.

Efter att provet har lyserats används ett centrifugrör för reningsproceduren.Provet laddas i centrifugröret och centrifugeras sedan.

Denna procedur är en fastfasextraktionsmetod där den stationära fasen består av en silikagelmatris.

Under optimala salt- och pH-förhållanden binder RNA-molekyler till kiselmembranet.

Samtidigt avlägsnas protein och andra föroreningar.

Efter centrifugering, placera centrifugröret i ett rent uppsamlingsrör, kassera filtratet och tillsätt sedan tvättbuffert.

Placera röret i centrifugen igen för att tvinga tvättbufferten genom membranet.Detta kommer att ta bort alla kvarvarande föroreningar från membranet och lämnar bara RNA bunden till silikagelen.

Efter att provet har tvättats, sätt röret i ett rent mikrocentrifugrör och tillsätt elueringsbufferten.

Den centrifugeras sedan för att tvinga elueringsbufferten genom membranet.Elueringsbufferten tar bort viralt RNA från spinnkolonnen och erhåller renat RNA fritt från proteiner, inhibitorer och andra föroreningar.

STEG 2

Blandat koncentrat

Efter att ha extraherat det virala RNA:t är nästa steg att förbereda reaktionsblandningen för PCR-amplifiering.I detta steg används koncentrat.Denna koncentrerade lösning är en förblandad koncentrerad lösning som består av en förblandning, omvänt transkriptas, nukleotider, framåtriktad primer, omvänd primer, TaqMan-sond och DNA-polymeras.

Slutligen, för att fullborda denna reaktionsblandning, tillsätts RNA-mallen.Rören blandas genom pulsvirvling och sedan laddas reaktionsblandningen i PCR-plattan.PCR-plattan innehåller vanligtvis 96 brunnar och kan analysera flera prover samtidigt.

STEG 3

PCR-amplifiering

Placera sedan plattan i PCR-maskinen, som i huvudsak är en termisk cykler.

Realtids-RT-PCR används för att detektera 2019 års nya coronavirus genom att amplifiera målsekvensen i RdrRP-genen, E-genen och N-genen.Valet av målgen beror på primern och probsekvensen.

Det första steget av RT-PCR är omvänd transkription.Den första strängen av komplementärt DNA syntetiseras, vilket initieras av PCR omvänd primer, som binder till den komplementära delen av det virala RNA-genomet.Sedan lägger omvänt transkriptas till DNA-nukleotider till 3'-änden av primern för att syntetisera DNA som är komplementärt till det virala RNA:t.Temperaturen och varaktigheten av detta steg beror på de använda primrarna, mål-RNA och omvänt transkriptas.

Därefter tillämpas ett initialt denatureringssteg, vilket resulterar i denatureringen av RNA-DNA-hybriden.Detta steg är nödvändigt för att aktivera DNA-polymeraset.Samtidigt inaktiveras omvänt transkriptas.

PCR består av en serie termiska cykler.Varje cykel består av denaturerings-, hybridiserings- och förlängningssteg.

Denatureringssteget involverar uppvärmning av reaktionskammaren till 95 grader Celsius och användning av den för denaturering av den dubbelsträngade DNA-mallen.

I nästa steg sänks reaktionstemperaturen till 58 grader Celsius, vilket gör att den främre primern kan hybridisera till den komplementära delen av dess enkelsträngade DNA-mall.Glödgningstemperaturen beror direkt på primerns längd och sammansättning.

I förlängningssteget syntetiserar DNA-polymeraset en ny DNA-sträng som är komplementär till DNA-mallsträngen.Genom att lägga till fria kärnor som är komplementära till mallen i 5'- till 3'-riktningen från reaktionsblandningen.Temperaturen för detta steg beror på det använda DNA-polymeraset.

Efter den första cykeln erhålls ett dubbelsträngat DNA-mål.

Gå sedan in i den andra cykeln.Det dubbelsträngade DNA:t denatureras för att producera två enkelsträngade DNA-molekyler.

I nästa steg sänks reaktionstemperaturen, primrarna hybridiseras till varje enkelsträngad DNA-mall och Taq-man-proben hybridiseras till den komplementära delen av mål-DNA:t.

TaqMan-proben består av en fluorofor kovalent kopplad till 5'-änden av oligonukleotidproben.När den exciteras av ljuskällan från cyklern, avger fluoroforen fluorescens.Dessutom är sonden sammansatt av en släckare i 3′änden.Närheten av reportergenen till quenchern förhindrar detektering av fluorescens.

I förlängningssteget syntetiserar DNA-polymeraset en ny sträng.När polymeraset når TaqMan-proben, klyver dess endogena 5'-nukleasaktivitet sonden, vilket separerar färgämnet från quenchern.

Med varje cykel av PCR frigörs fler färgämnesmolekyler, vilket resulterar i en ökning av fluorescensintensiteten proportionell mot antalet syntetiserade amplikoner.

Denna metod gör det möjligt att uppskatta antalet av en given sekvens som finns i provet.Antalet dubbelsträngade DNA-fragment fördubblas i varje cykel.Därför kan PCR användas för att analysera mycket små prover.

För mätning av fluorescerande signal, volframhalogenlampa, excitationsfilter, reflektor, lins, emissionsfilter och laddningskopplad enhet använd CCD-kamera.

STEG 4 Detektera

För mätning av fluorescerande signal, volframhalogenlampa, excitationsfilter, reflektor, lins, emissionsfilter och laddningskopplad enhet använd CCD-kamera.

Det filtrerade ljuset från lampan reflekteras av reflektorn, passerar genom kondensorlinsen och fokuseras till mitten av varje hål.Sedan reflekteras fluorescensen som emitteras från hålet från spegeln, passerar genom emissionsfiltret och detekteras av CCD-kameran.I varje PCR-cykel kan det självexciterade fluoroforljuset detekteras av CCD:n.

Den omvandlar det fångade ljuset till digital data.Denna metod kallas realtids-PCR, och den tillåter realtidsövervakning av PCR-reaktionens fortskridande.