PCR, flera olika PCR, In situ PCR, Omvänd PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Vi kommer att reda ut koncept, steg och detaljer för olika PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, kallad PCR, är en molekylärbiologisk teknologi som används för att förstora specifika DNA-fragment.Det kan betraktas som en speciell DNA-replikation in vitro.DNA-polymeras (DNA Polymerase I) upptäcktes redan 1955, och Klenow Fragment of E. Coli, som har experimentellt värde och praktisk funktion, upptäcktes av Dr. H. Klenow i början av 1970-talet, men eftersom detta enzym inte tål temperatur kan hög temperatur degenerera det, så det möter inte polymeraskedjereaktionen vid hög temperatur.De enzymer som används idag (kallas Taq-polymeras), isolerades från Thermus aquaticus, en bakterie i varma källor 1976. Dess kännetecken är att den tål höga temperaturer och är ett idealiskt enzym, men det används i stor utsträckning efter 1980-talet.Det ursprungliga konceptet med den ursprungliga primitiva prototypen av PCR liknar genreparation och kopiering, som föreslogs av Dr KJell Kleppe 1971. Han publicerade den första enkla och kortsiktiga genkopian (liknande de två första cykelreaktionerna av PCR).Den PCR som utvecklas idag utvecklades av Dr. Kary B. Mullis 1983. Dr. Mullis tjänade PE-företag det året, så PE har en speciell status inom PCR-branschen.Dr. Mullis publicerade officiellt den första relaterade artikeln med Saiki och andra 1985. Sedan dess är användningen av PCR tusentals mil om dagen, och kvaliteten på relaterade artiklar kan sägas göra många andra forskningsmetoder obehagliga.Därefter används PCR-teknik i stor utsträckning i biologisk vetenskaplig forskning och kliniska tillämpningar, och blir den viktigaste teknologin för molekylärbiologisk forskning.Mullis vann också 1993 års Nobelpris i kemi.

PCRPrincip

Grundprincipen för PCR-teknologi liknar den naturliga replikeringsprocessen av DNA, och dess specificitet beror på oligonukleotidprimern som är komplementär till båda ändarna av målsekvensen.PCR består av degeneration-annealing-förlängning av tre grundläggande reaktionssteg: ①Degenerering av mall-DNA: Efter att mall-DNA har värmts upp till cirka 93°C under en viss tid, gör den dubbel-DNA-lösning för dubbelkedjiga DNA som bildas genom PCR-amplifieringen av mall-DNA:t som lämnar, göra det till en enda kedja med primerreaktionen så att den kan kombineras för nästa primerreaktion.②Anlöpningen (föreningen) av mall-DNA:t och primern: Efter att mall-DNA:t har upphettats och degenererats till en enda kedja, sjunker temperaturen till cirka 55°C.Den komplementära sekvensen av primern och mall-DNA enkelkedja.③Förlängningen av primern: DNA-mall - primerbindningen är baserad på verkan av TaqDNA-polymeras, med dNTP som reaktionsråvara.Behåll replikationsprincipen, syntetisera en ny semi-reserverad kopiakedja som kompletterar mall-DNA-kedjan och upprepa cykeldegeneration-annealing-extension tre processer kan få mer "semi-reserved copy chain", och denna nya kedja är tillgänglig igen Bli en mall för nästa cykel.Det tar 2-4min att slutföra loopen, målgenen kan amplifieras flera miljoner gånger på 2-3 timmar.

StandardPCRReaktionssystem

Fem element i PCR-reaktion

Det finns huvudsakligen fem sorters substanser involverade i PCR-reaktionen, nämligen primer, enzym, dNTP, mall och buffert (Mg2+ krävs).[PCR-förfarande]

Standard-PCR-processen är uppdelad i tre steg

1. DNA-degenerering (90°C-96°C): Dubbelkedjiga DNA-mallar under termisk verkan, vätebindningar bryts och bildar ett enkelkedjigt DNA.

2. Glödgning (25℃ -65℃): Systemtemperaturen sänks, primern kombineras med DNA-mallen för att bilda en lokal dubbelkedja.

3. Förlängning (70℃ -75℃): Under verkan av Taq-enzymet (ca 72°C, den bästa aktiviteten), används dNTP som råmaterial, sträcker sig från 5′-änden av primern → 3′-änden, syntes och mall kompletterar varandras DNA-kedja.

Varje cykel denatureras, härdas och förlängs, vilket fördubblar DNA-innehållet.För närvarande, på grund av det korta amplifieringsområdet, kan en del PCR replikeras på mycket kort tid även om Taq-enzymaktiviteten inte är optimal, så den kan ändras till två steg, det vill säga att hybridiseringen och förlängningen kan utföras vid 60°C-65°C samtidigt.För att minska processen att lyfta och kyla och förbättra svarshastigheten.

PCR-reaktionsfunktioner

● Hög specificitet

De specifika avgörande faktorerna för PCR-svaret är: ①Den specifika kombinationen av primern och mall-DNA.②Principen för basparning.③Lojaliteten hos TaqDNA-polymerassyntesreaktionen.④Målgenens specificitet och konservativitet.

Den korrekta kombinationen av primers och mallar är nyckeln.Bindningen av primern och mallen och förlängningen av primerkedjan är baserade på principen om alkalisk basmatchning.Lojaliteten hos polymerassyntesreaktioner och den höga temperaturbeständigheten hos Taq DNA-polymeraset för att göra bindningen (föreningen) av mallen och primern i reaktionen kan utföras vid en högre temperatur.Kombinationens specificitet ökar kraftigt.Klippet kan bibehålla en hög grad av korrekthet.Genom att välja en genetisk målregion med hög konservativitet och hög konservativitet blir dess specificitet högre.

● Hög känslighet

Produktionsvolymen för PCR-produkter ökas med index, vilket kan utöka startmallen för Picker (PG=10-12) för att öka nivån av mikrokontroller till nivån av mikrogram (μg= -6).En målcell kan detekteras från 1 miljon celler;vid detektering av virus kan känsligheten för PCR nå 3 RFU (tomma fläckar bildade enheter);den lägsta upptäcktshastigheten inom bakterievetenskap är 3 bakterier.

● Enkelt och snabbt

PCR-reflektionen använder ett högtemperatur Taq DNA-polymeras, som tillsätter reaktionslösningen på en gång, det vill säga en degenerations-anneal-förlängningsreaktion på DNA-amplifieringslösningen och vattenbadskrukan.I allmänhet fullbordas amplifieringsreaktionen på 2 till 4 timmar.Förstärkta produkter analyseras i allmänhet med elektriska svärd, och behöver inte använda isotoper, ingen radioaktiv förorening och enkel marknadsföring.

● Renheten på provet är låg

Det finns inget behov av att separera virus eller bakterier och odlingsceller.DNA-råprodukter och RNA kan användas som förstärkare.Detektion av DNA-amplifiering kan användas direkt med hjälp av kliniska prover som blod, kroppsvätska, hosttvättvätska, hår, celler och levande vävnad.

PCRvanliga problem

● Falskt negativ, inga förstärkta band

Nyckelstadierna i PCR-reaktionen inkluderar: ① beredning av mallnukleinsyror, ② kvalitet och specificitet för primrar, ③ kvaliteten på enzymer ④ PCR-cykelförhållanden.Att hitta orsaken bör också analyseras och studeras för ovanstående länkar.

Mallar: ① Mallen innehåller diverse protein, ② Mallen innehåller en Taq-enzymhämmare, ③ Proteinet i mallen elimineras inte, speciellt gruppproteinet i kromosomen.⑤ Deminer-nukleinsyradegenerering är inte grundlig.När kvaliteten på enzymer och primrar är bra finns det inget amplifieringsband, vilket med största sannolikhet är matsmältningsbehandlingen av prover.Det är något fel med mallnukleinsyraextraktionsprocessen, så för att förbereda en effektiv och stabil digestionslösning bör dess procedur fixas och inte godtyckligt ändras.

Enzyminaktivering: ett nytt enzym eller både gamla och nya enzymer bör användas tillsammans för att analysera om enzymaktiviteten är förlorad eller otillräcklig, vilket leder till falska negativa effekter.Det bör noteras att Taq-enzym eller etidiumbromid ibland glöms bort.

Primer: kvaliteten på primern, koncentrationen av primern och om koncentrationen av de två primers är symmetrisk.Det är en vanlig orsak till PCR-felet eller så är det ökande bandet inte idealiskt och benäget att diffundera.Det finns problem med kvaliteten på primrarna för vissa batchnummer.De två primrarna har en hög koncentration och en låg koncentration, vilket orsakar lågeffektiv asymmetrisk amplifiering.Motåtgärderna är: ① Välj en bra primer för att syntetisera enheter.② Koncentrationen av primern beror inte bara på OD-värdet, utan uppmärksammar också primerns ursprungliga vätska för att göra agarsockergelelektrofores.Det måste finnas en primerremszon, och ljusstyrkan på de två primrarna bör vara generellt konsekvent.Bälte, PCR kan misslyckas vid denna tidpunkt, och det bör lösas med primersyntesenheten.Om en primer är hög är ljusstyrkan låg och dess koncentration måste balanseras när den späds ut.③ Primern bör betalas och förvaras i en hög koncentration för att förhindra flera frysningar eller långvariga kyldelar av kylskåpet, vilket kommer att göra att primern försämras och försämras.④ Utformningen av primern är orimlig, såsom längden på primern är otillräcklig, och diclustern bildas mellan primern.

Mg2+koncentration: Mg2+jonkoncentration har stor inverkan på PCR-amplifieringseffektiviteten.Överdriven koncentration kan minska det motsatta könet av PCR-amplifiering.Om koncentrationen är för låg kommer PCR-förstärkningsutgången till och med att göra att PCR-förstärkningen misslyckas utan expansionsbandet.

Förändring av reaktionsvolym: Volymen som används vid PCR-amplifiering är 20 ul, 30 ul och 50 ul eller 100 ul, den stora volymen för ansökan om PCR-amplifiering ställs in i enlighet med olika syften med vetenskaplig forskning och kliniska tester.Efter att ha gjort små volymer som 20ul, är det nödvändigt att göra ett sladdtillstånd när du gör storleken, annars kommer det att misslyckas.

Fysiska skäl: Transformation är mycket viktig för PCR-amplifiering.Om degenerationstemperaturen är låg, degenerationstiden är kort, det är sannolikt att det inträffar i falskt negativ;för låg glödgningstemperatur kan orsaka ospecifik amplifiering och minska specifik amplifieringseffektivitet.Påverkar starkt kombinationen av primers och mallar för att minska PCR-amplifieringseffektiviteten.Ibland är det nödvändigt att använda standardtermometrar för att upptäcka variationen, glödgningen och den förlängda temperaturen i förlängningen eller den vattenlösliga kokaren, vilket är en av anledningarna till att PCR misslyckades.

Målsekvensvarianter: Om målsekvensen inträffar, en mutation eller deletion, kombineras kombinationen av prototypen och mallen, eller på grund av avsaknaden av en målsekvens kommer primern och mallen att förlora den komplementära sekvensen, och dess PCR-amplifiering kommer inte att lyckas.

● Falskt positivt

PCR-amplifieringsbandet verkar överensstämma med målsekvensbandet, och ibland är dess band mer snyggt och högre.

Primerdesign är inte lämplig: den valda amplifieringssekvensen och icke-ändamålsamplifieringssekvensen är homologa, så vid PCR-amplifiering är de amplifierade PCR-produkterna icke ändamålsenliga sekvenser.Målsekvensen är för kort eller primern är för kort och den är benägen att bli falsk positiv.Behöver designas om.

Korsförorening av målsekvens eller amplifieringsprodukter: Det finns två orsaker till denna förorening: För det första korsförorening av hela genomet eller stora segment, vilket leder till falska positiva resultat.Denna typ av falska positiva kan lösas med följande metoder: Var försiktig och försiktig under drift för att förhindra att målsekvensen andas in i provpistolen eller stänker ut ur centrifugalröret.Förutom enzymer och ämnen som inte tål höga temperaturer, bör alla reagenser eller utrustning desinficeras med högt tryck.Centrifugalrören och proverna ska användas på en gång.Vid behov, innan prover tillsätts, exponeras reaktionsröret och reagenset för ultravioletta strålar för att förstöra den befintliga nukleinsyran.För det andra, små fragment i luftföroreningarna.Dessa små fragment är kortare än målsekvensen, men de har viss homologi.Det kan skarvas med varandra.Efter att ha kompletterat primrarna kan PCR-produkten expanderas, vilket kommer att orsaka falsk positiv produktion.Den kan användas för att minska eller eliminera nest-PCR-metoden.

● Visas ospecifikt förstärkningsband

Banden som uppträdde efter PCR-amplifiering är oförenliga med den förväntade storleken, eller stora eller små, eller samtidigt, eller samtidigt, specifika amplifieringsband och icke-specifika amplifieringsband.Uppkomsten av icke-specifika band är: För det första är primrarna ofullständiga komplementära till målsekvensen, eller polymerisationen av primern för att bilda ett dikluster.Den andra är att koncentrationen av MG2+joner är för hög, glödgningstemperaturen är för låg och antalet PCR-cykler är relaterat.För det andra kvaliteten och mängden av enzymer.Ofta är enzymer från vissa källor benägna för icke-speciella band och enzymerna från den andra källan förekommer inte.Ibland förekommer också ospecifik amplifiering av enzymer.Motåtgärderna är: omdesignade attraktiva vid behov.Minska mängden enzym eller byt ut enzymet från en annan källa.Minska mängden primära, öka mängden mallar på lämpligt sätt och minska antalet cykler.Öka glödgningstemperaturen på rätt sätt eller använd metoden med två temperaturpunkter (93°C degenerering, glödgning och förlängning vid ca 65°C).

● Verka flagnande släp eller kladdtejp

PCR-amplifiering verkar ibland vara applicerad eller skalad eller mattliknande bälte.Av anledningen, på grund av den överdrivna mängden enzymer eller den dåliga kvaliteten på enzymet, är dNTP-koncentrationen för hög, Mg2+-koncentrationen är för hög, glödgningstemperaturen är för låg och antalet cykler är för mycket.Motåtgärderna är: ①Minska mängden enzymer, eller ändra enzymet från en annan källa.②Minska koncentrationen av dNTP ③Minska Mg2+-koncentrationen korrekt.④Öka antalet mallar och minska antalet cykler.

Relaterade produkter

PCR Heroᵀᴹ (med färg)

◮ Högre trohet: 6 gånger högre än vanligt Taq-enzym;

◮ Snabbare förstärkningshastighet

◮ Mer mallanpassningsförmåga

◮ Högre förstärkningseffektivitet

◮ Miljötoleransen är starkare: placerad vid 37°C i en vecka, bibehåller mer än 90 % aktivitet;

◮ Den har 5'→3' DNA-polymerasaktivitet och 5'→3' exonukleasaktivitet, utan 3'→5' exonukleasaktivitet.

PCR Easyᵀᴹ (med färg)

Det unika reaktionssystemet och högeffektiva Taq DNA-polymeras gör att PCR-reaktionen har högre amplifieringseffektivitet, specificitet och känslighet.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Grön I

◮ Enstegskit gör omvänd transkription och qPCR två reaktioner i samma rör, behöver bara lägga till mall-RNA, specifika PCR-primers och RNase-fri ddH₂O.

◮ Kitet kan snabbt och effektivt kvantitativt analysera viralt RNA eller spåra RNA.

◮ Kittet använder ett unikt Foregene omvänd transkriptionsreagens och Foregene HotStar Taq DNA-polymeras kombinerat med ett unikt reaktionssystem för att effektivt förbättra amplifieringseffektiviteten och specificiteten för reaktionen.

◮ Det optimerade reaktionssystemet gör att reaktionen har högre detektionskänslighet, starkare termisk stabilitet och bättre tolerans.

◮ RT-qPCR Enkel^TM(One Step)-SYBR Green I kit kommer med ROX intern referensfärg, som kan användas för att eliminera signalbakgrund och signalfel mellan brunnar, vilket är bekvämt för kunder att använda i olika modeller av kvantitativa PCR-instrument.

RT lätt^TMII (Master Premix för första-strängs cDNA-syntes förRealtids PCR)

-Effektiv förmåga att ta bort gDNA, vilket kan ta bort gDNA i mallen inom 2 minuter.

-Effektivt omvänt transkriptionssystem, det tar bara 15 minuter att slutföra syntesen av den första strängens cDNA.

-Komplexa mallar: mallar med högt GC-innehåll och komplex sekundär struktur kan också vändas med hög effektivitet.

-Högkänsligt omvänt transkriptionssystem, mallar på pg-nivå kan också få cDNA av hög kvalitet.

- Det omvända transkriptionssystemet har hög termisk stabilitet, den optimala reaktionstemperaturen är 42 ℃, och det har fortfarande bra omvänd transkriptionsprestanda vid 50 ℃.