Ct-värdet är den viktigaste resultatpresentationsformen av fluorescerande kvantitativ PCR.Den används för att beräkna genuttrycksskillnader eller genkopietal.Så vad anses Ct-värdet för fluorescenskvantifiering vara rimligt?Hur säkerställer man ett effektivt Ct-värde?
Vad är Ct-värde?
Under qPCR-amplifieringsprocessen, motsvarande antal amplifieringscykler (Cycle Threshold) när fluorescenssignalen för den amplifierade produkten når den inställda fluorescenströskeln.C står för Cycle och T står för Threshold.Enkelt uttryckt är Ct-värdet antalet cykler som motsvarar när den initiala mallförstärkningen når en viss mängd produkt i qPCR.Den så kallade "en viss mängd produkt" kommer att förklaras ytterligare senare.
Vad gör Ct-värdet?
1.Släktskap mellan exponentiell förstärkning, mallmängd och Ct-värde
Helst ackumuleras gener i qPCR genom exponentiell amplifiering efter ett visst antal cykler.Förhållandet mellan antalet amplifieringscykler och mängden produkter är: Amplifierad produktmängd = initial mallmängd × (1+En) cyklers antal.Men qPCR-reaktionen är inte alltid i en idealisk situation.När mängden amplifierad produkt når en "viss produktmängd", är antalet cykler vid denna tidpunkt Ct-värdet, och det är i den exponentiella amplifieringsperioden.Förhållandet mellan Ct-värdet och mängden startmall: Det finns ett linjärt samband mellan mallens Ct-värde och logaritmen för mallens startnummer.Ju högre initial mallkoncentration, desto mindre Ct-värde;ju lägre initial mallkoncentration, desto högre Ct-värde.
2. Amplifieringskurva, fluorescenströskel och viss PCR-produktmängd
Mängden qPCR-amplifieringsprodukt presenteras direkt i form av fluorescerande signal, det vill säga amplifieringskurvan.I det tidiga skedet av PCR är amplifieringen under ideala förhållanden, antalet cykler är litet, produktackumuleringen är liten och nivån av fluorescens kan inte tydligt särskiljas från fluorescensbakgrunden.Därefter ökar fluorescensen och går in i den exponentiella fasen.Mängden PCR-produkt kan detekteras vid en viss punkt när PCR-reaktionen bara är i exponentiell fas, vilket kan användas som "en viss mängd produkt", och det initiala innehållet i mallen kan härledas från detta.Därför är fluorescenssignalintensiteten som motsvarar en viss mängd produkt fluorescenströskeln.
I det sena skedet av PCR visar amplifieringskurvan inte längre exponentiell amplifiering och går in i den linjära fasen och platåfasen.
3.Reproducerbarhet av Ct-värden
När PCR-cykeln når cykelnumret för Ct-värdet har den precis gått in i den sanna exponentiella amplifieringsperioden.Vid denna tidpunkt har det lilla felet inte förstärkts, så reproducerbarheten av Ct-värdet är utmärkt, det vill säga samma mall förstärks vid olika tidpunkter eller i olika rör samtidigt.Amplifiering, det erhållna Ct-värdet är konstant.
1. Amplifieringseffektivitet Sv
PCR-amplifieringseffektivitet avser effektiviteten med vilken polymeraset omvandlar genen som ska amplifieras till ett amplikon.Amplifieringseffektiviteten när en DNA-molekyl transformeras till två DNA-molekyler är 100 %.Amplifieringseffektivitet uttrycks vanligtvis som En.För att underlätta analysen av efterföljande artiklar introduceras kortfattat de faktorer som påverkar amplifieringseffektiviteten.
| Påverkande faktorer | förklaring | Hur ska man döma? |
| A. PCR-hämmare | 1. Mall-DNA innehåller ämnen som hämmar PCR-reaktionen, såsom proteiner eller tvättmedel.2. cDNA:t efter omvänd transkription innehåller en hög koncentration av mall-RNA eller RT-reagenskomponenter, som också kan hämma den efterföljande PCR-reaktionen. | 1. Om det finns föroreningar kan bedömas genom att mäta förhållandet mellan A260/A280 och A260/A230 eller RNA-elektrofores.2. Huruvida cDNA späds ut enligt ett visst förhållande efter omvänd transkription. |
| B. Felaktig primerdesign | Primers härdar inte effektivt | Kontrollera primers för primer-dimers eller hårnålar, felmatchningar och ibland spännande introniska mönster. |
| C. Felaktig design av PCR-reaktionsprogram | 1. Primers kan inte härda effektivt2. Otillräcklig frisättning av DNA-polymeras 3. Långvarig högtemperatur DNA-polymerasaktivitet minskade | 1. Glödgningstemperaturen är högre än TM-värdet för primern2. Fördenatureringstiden är för kort 3. Tiden för varje steg i reaktionsproceduren är för lång |
| D. Otillräcklig blandning av reagenser eller pipetteringsfel | I reaktionssystemet är den lokala koncentrationen av PCR-reaktionskomponenter för hög eller ojämn, vilket resulterar i icke-exponentiell amplifiering av PCR-amplifiering | |
| E. Amplikonlängd | Amplikonens längd är för lång, överstiger 300 bp, och amplifieringseffektiviteten är låg | Kontrollera att amplikonlängden är mellan 80-300 bp |
| F. Inverkan av qPCR-reagens | Koncentrationen av DNA-polymeras i reagenset är låg eller koncentrationen av joner i bufferten är inte optimerad, vilket resulterar i att Taq-enzymaktiviteten inte når det maximala | Bestämning av amplifieringseffektivitet genom standardkurva |
2.Omfång av Ct-värden
Ct-värden varierar från 15-35.Om Ct-värdet är mindre än 15 anses amplifieringen vara inom intervallet för baslinjeperioden och fluorescenströskeln har inte uppnåtts.Helst finns det ett linjärt samband mellan Ct-värdet och logaritmen för mallens initiala kopianummer, det vill säga standardkurvan.Genom standardkurvan, när amplifieringseffektiviteten är 100 %, är det beräknade Ct-värdet för att kvantifiera genens enkelkopietal runt 35. Om det är större än 35 är det initiala kopiantalet för mallen teoretiskt mindre än 1, vilket kan anses meningslöst.
För olika gen-Ct-intervall, på grund av skillnaden i genkopietal och amplifieringseffektivitet i den initiala mallmängden, är det nödvändigt att göra en standardkurva för genen och beräkna det linjära detektionsintervallet för genen.
3. Påverkande faktorer för Ct-värdet
Från förhållandet mellan antalet amplifieringscykler och mängden produkt: mängd amplifierad produkt = mängd initial mall × (1+En) cykelnummer, kan man se att under idealiska förhållanden påverkas mängden initial mall och En negativt på Ct-värdet.Skillnaden i mallkvalitet eller amplifieringseffektivitet kommer att göra att Ct-värdet blir för stort eller för litet.
4.Ct-värdet är för stort eller för litet
Posttid: 22-2-2023
