Hörselnedsättning (HL) är den vanligaste sensoriska funktionsnedsättningssjukdomen hos människor.I utvecklade länder orsakas cirka 80 % av fall av prelingual dövhet hos barn av genetiska faktorer.De vanligaste är defekter med en gen (som visas i fig. 1), 124 genmutationer har visat sig vara associerade med icke-syndromisk hörselnedsättning hos människor, resten orsakas av miljöfaktorer.Ett cochleaimplantat (en elektronisk enhet placerad i innerörat som ger elektrisk stimulering direkt till hörselnerven) är det i särklass mest effektiva alternativet för att behandla svår HL, medan en hörapparat (en extern elektronisk enhet som omvandlar och förstärker ljudvågor) kan hjälpa patienter med måttlig HL.Men det finns för närvarande inga läkemedel tillgängliga för att behandla ärftlig HL (GHL).Under de senaste åren har genterapi fått ökad uppmärksamhet som ett lovande tillvägagångssätt för att behandla innerörats dysfunktion.

Figur 1.Fördelning av dövhetsassocierad variationstyp.[1]

Nyligen publicerade forskare från Salk Institute och University of Sheffield ett forskningsresultat i Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], som visade breda tillämpningsmöjligheter för in vivo genterapi av ärftlig dövhet.Uri Manor, biträdande forskningsprofessor vid Salk Institute och chef för Waitt Center for Advanced Biophotonics, sa att han föddes med allvarlig hörselnedsättning och kände att återställande av hörseln skulle vara en underbar gåva.Hans tidigare forskning fann att Eps8 är ett aktinreglerande protein med aktinbindande och täckande aktiviteter;i cochlea hårceller finns proteinkomplexet som bildas av Eps8 med MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 och GNAI3 främst i de flesta Spetsarna av långa stereocilier, som tillsammans med MYO15A lokaliserar BAIAP2L2 i spetsarna av kortare stereocilier, krävs för underhåll av hårbuntar.Därför kan Eps8 reglera längden på hårcellernas stereocilier, vilket är avgörande för normal hörselfunktion;Eps8-deletion eller -mutation kommer att leda till korta stereocilier, vilket gör att den inte kan omvandla ljud ordentligt till elektriska signaler för hjärnans uppfattning, vilket i sin tur leder till dövhet..Samtidigt fann kollaboratören Walter Marcotti, professor vid University of Sheffield, att hårceller inte kan utvecklas normalt i frånvaro av Eps8.I denna studie gick Manor och Marcotti ihop för att undersöka om att lägga till Eps8 till stereociliära celler kunde återställa deras funktion och i sin tur förbättra hörseln hos möss.Forskargruppen använde den adenoassocierade virusvektorn (AAV) Anc80L65 för att leverera den kodande sekvensen som innehåller vildtyp EPS8 till snäckan hos Eps8-/- nyfödda P1-P2-möss genom injektion med runda fönstermembran;i mus cochlea hårceller Funktionen av stereocilia reparerades innan de mognade;och reparationseffekten kännetecknades av bildteknik och mätning av stereocilier.Resultaten visade att Eps8 ökade längden på stereocilier och återställde hårcellsfunktionen i lågfrekventa celler.De fann också att cellerna med tiden verkade förlora sin förmåga att räddas av denna genterapi.Innebörden är att denna behandling kan behöva administreras in utero, eftersom Eps8-/- hårceller kan ha mognat eller samlat på sig skada som inte går att reparera efter att mössen föddes."Eps8 är ett protein med många olika funktioner, och det finns fortfarande mycket att utforska," sa Manor.Framtida forskning kommer bland annat att undersöka effekten av Eps8-genterapi för att återställa hörseln i olika utvecklingsstadier, och om det kan vara möjligt att förlänga behandlingsmöjligheterna.Av en slump publicerade professor KarenB Avraham vid Tel Aviv University i Israel i november 2020 sina resultat i tidskriften EMBO Molecular Medicine [3], med hjälp av en innovativ genterapiteknik för att skapa ett ofarligt syntetiskt adenoassocierat virus AAV9-PHP.B, Gendefekten i hårcellerna hos Syne4-/- möss reparerades genom att injicera ett virus som bär den kodande sekvensen för Syne4 i innerörat hos möss, vilket lät det komma in i hårcellerna och frigöra det medförda genetiska materialet, vilket gör att de kan mogna och fungera normalt (som i Fig. 2).

Fig2.Schematisk representation av innerörats anatomi, med fokus på Cortis organ och den cellulära funktionen av nesprin-4.

Man kan se att användningen av genterapi för att uppnå syftet att behandla ärftliga sjukdomar på gennivå genom att sätta in, ta bort eller korrigera eventuella muterade gener för behandling (det vill säga kontrollera de genetiska förändringarna i sjukdomen) har en hög klinisk effekt.ansökningsmöjligheter.De nuvarande genterapimetoderna för genetiskt defekt dövhet kan delas in i följande kategorier:

genersättning

Genersättning är utan tvekan den mest "enkla" formen av genterapi, baserad på att identifiera och ersätta en defekt gen med en normal eller vildtypskopia av genen.Första framgångsrika genterapistudie för innerörat för hörselnedsättning orsakad av deletion av genen för vesikulär glutamattransportör 3 (VGLUT3);AAV1-medierad leverans av exogent VGLUT3-överuttryck i hårceller i innerörat (IHC) kan resultera i ihållande återhämtning av hörseln, partiell återhämtning av bandsynaptisk morfologi och konvulsiva svar [4].Men i exemplen inklusive de två AAV-levererade genersättningarna som beskrivs i introduktionen ovan är det viktigt att notera att musmodellerna som används för vissa typer av gendeletion ärftliga hörselnedsättningar är temporärt olika från människor, och hos P1-möss är innerörat i det mogna utvecklingsstadiet.Däremot föds människor med ett moget inneröra.Denna skillnad förhindrar möjlig tillämpning av musresultaten för behandling av mänskliga ärftliga dövhetsstörningar om inte genterapi levereras till mogna musöron.

Genredigering: CRISPR/Cas9

Jämfört med "genersättning" har utvecklingen av genredigeringsteknik lett till början av behandling av genetiska sjukdomar från roten.Viktigt är att genredigeringsmetoden kompenserar för bristerna med traditionella överuttrycksgenterapimetoder som inte är lämpliga för dominerande ärftliga dövhetssjukdomar, och problemet att överuttrycksmetoden inte varar länge.Efter att kinesiska forskare specifikt slog ut Myo6C442Y-mutantallelen i Myo6WT/C442Y-möss med hjälp av AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2-genredigeringssystemet, och inom 5 månader efter knockouten återställdes möss. Modellens hörselfunktion återställdes;samtidigt observerades det också att överlevnaden av hårceller i innerörat förbättrades, formen på flimmerhåren blev regelbunden och de elektrofysiologiska indikatorerna korrigerades [5].Detta är den första studien i världen som använder CRISPR/Cas9-teknologi för behandling av ärftlig dövhet orsakad av Myo6-genmutation, och det är ett viktigt forskningsframsteg inom genredigeringsteknik för behandling av ärftlig dövhet.Den kliniska översättningen av behandlingen ger en solid vetenskaplig grund.

Leveransmetoder för genterapi

För att genterapi ska bli framgångsrik kan nakna DNA-molekyler inte penetrera celler effektivt på grund av deras hydrofilicitet och negativa laddning av fosfatgrupper, och för att säkerställa integriteten hos de kompletterade nukleinsyramolekylerna måste en säker och effektiv metod väljas.Det kompletterade DNA:t levereras till målcellen eller vävnaden.AAV används i stor utsträckning som leveransvehikel för sjukdomsbehandling på grund av dess höga infektionseffekt, låga immunogenicitet och breda tropism till olika vävnadstyper.För närvarande har en stor mängd forskningsarbete bestämt tropismen hos olika subtyper av AAV i förhållande till olika celltyper i mussnäckan.Genom att använda AAV-leveransegenskaper i kombination med cellspecifika promotorer kan cellspecifikt uttryck uppnås, vilket kan minska effekter utanför målet.Dessutom, som ett alternativ till traditionella AAV-vektorer, utvecklas ständigt nya syntetiska AAV-vektorer som visar överlägsen transduktionsförmåga i innerörat, varav AAV2/Anc80L65 är den mest använda.Icke-virala leveransmetoder kan ytterligare delas in i fysikaliska metoder (mikroinjektion och elektroporering) och kemiska metoder (lipidbaserade, polymerbaserade och guldnanopartiklar).Båda metoderna har använts vid behandling av ärftliga dövhetssjukdomar och har visat olika fördelar och begränsningar.Förutom leveransvehikeln för genterapi som en vehikel, kan olika tillvägagångssätt för in vivo-genadministrering användas baserat på olika målcelltyper, administreringsvägar och terapeutisk effektivitet.Innerörats invecklade struktur gör det svårt att nå målceller och distributionen av genomredigeringsmedel är långsam.Den membranösa labyrinten är belägen inom benlabyrinten av tinningbenet och inkluderar cochleakanalen, halvcirkelformad kanal, utrikel och ballong.Dess relativa isolering, minimala lymfcirkulation och separation från blodet genom en blod-labyrintbarriär begränsar den effektiva systemiska tillförseln av läkemedel endast till neonatala möss.För att erhålla virala titrar lämpliga för genterapi är direkt lokal injektion av virala vektorer i innerörat nödvändig.Etablerade injektionsvägar inkluderar [6]: (1) runda fönstermembran (RWM), (2) trakeostomi, (3) endolymfatisk eller perilymfatisk cochleostomi, (4) runda fönstermembran plus tubfenestration (CF) (som i fig. 3).

Fig 3.Innerörat leverans av genterapi.

Även om många framsteg har gjorts inom genterapi, baserat på kliniska translationella mål, måste mer arbete göras innan genterapi kan bli ett förstahandsbehandlingsalternativ för patienter med genetiska sjukdomar, särskilt i utvecklingen av säkra och effektiva vektorer och leveransmetod.Men vi tror att den här typen av behandlingar inom en snar framtid kommer att bli en stapelvara i personlig terapi och kommer att ha en enormt positiv inverkan på livet för människor med genetiska störningar och deras familjer.

Foregene har även lanserat ett screeningkit med hög genomströmning för riktade gener, som är snabbt och kan utföra omvänd transkription och qPCR-reaktioner utan RNA-extraktion.

Produktlänkar

Cell Direct RT-qPCR-kit—Taqman/SYBR GREEN I

För mer produktinformation, vänligen kontakta:

overseas@foregene.com