Tekniken för molekylär diagnostik använder molekylärbiologiska metoder för att upptäcka uttrycket och strukturen av det genetiska materialet i människokroppen och olika patogener, för att uppnå syftet att förutsäga och diagnostisera sjukdomar.

Under de senaste åren, med uppgraderingen och iterationen av molekylär diagnostisk teknologi, har den kliniska tillämpningen av molekylär diagnostik blivit mer och mer omfattande och djupgående, och marknaden för molekylär diagnostik har gått in i en period av snabb utveckling.

Författaren sammanfattar de vanliga molekylära diagnostiska teknologierna på marknaden och är uppdelad i tre delar: den första delen introducerar PCR-teknologin, den andra delen introducerar nukleinsyrans isotermiska amplifieringsteknologi och den andra delen introducerar sekvenseringsteknologin.

01

Del I: PCR-teknik

PCR-teknik

PCR (polymeraskedjereaktion) är en av in vitro DNA-amplifieringsteknologierna, med en historia på mer än 30 år.

PCR-teknologin var pionjär 1983 av Kary Mullis från Cetus, USA.Mullis ansökte om ett PCR-patent 1985 och publicerade det första akademiska PCR-dokumentet om vetenskap samma år.Mullis vann Nobelpriset i kemi 1993.

Grundläggande principer för PCR

PCR kan amplifiera mål-DNA-fragment med mer än en miljon gånger.Principen är att under katalys av DNA-polymeras används modersträngens DNA som mall och en specifik primer används som utgångspunkt för förlängning.Det replikeras in vitro genom steg som denaturering, hybridisering och förlängning.Processen med dottersträngs-DNA som är komplementär till modersträngens mall-DNA.

Standard PCR-processen är uppdelad i tre steg:

1. Denaturering: Använd hög temperatur för att separera DNA-dubbelsträngar.Vätebindningarna mellan DNA-dubbelsträngarna bryts vid höga temperaturer (93-98°C).

2. Glödgning: Efter att det dubbelsträngade DNA:t separerats sänks temperaturen så att primern kan binda till det enkelsträngade DNA:t.

3. Förlängning: DNA-polymeraset börjar syntetisera komplementära strängar längs DNA-strängarna från primrarna bundna när temperaturen sänks.När förlängningen är klar fullbordas en cykel och antalet DNA-fragment fördubblas.

Genom att upprepa dessa tre steg 25-35 gånger kommer antalet DNA-fragment att öka exponentiellt.

Det uppfinningsrika med PCR är att olika primrar kan designas för olika målgener, så att målgenfragmenten kan amplifieras på kort tid.

Hittills kan PCR delas in i tre kategorier, nämligen vanlig PCR, fluorescerande kvantitativ PCR och digital PCR.

Den första generationen av vanlig PCR

Använd ett vanligt PCR-amplifieringsinstrument för att amplifiera målgenen och använd sedan agarosgelelektrofores för att detektera produkten, endast kvalitativ analys kan göras.

De största nackdelarna med den första generationens PCR:

- Benägen till ospecifik amplifiering och falskt positiva resultat.

-Detekteringen tar lång tid och operationen är krånglig.

-Endast kvalitativ testning kan göras.

Andra generationens fluorescens kvantitativ PCR

Fluorescenskvantitativ PCR (Real-Time PCR), även känd som qPCR, används för att övervaka ackumuleringen av amplifierade produkter genom ackumulering av fluorescerande signaler genom att lägga till fluorescerande prober som kan indikera reaktionssystemets förlopp och för att bedöma resultaten genom fluorescenskurvan, och det kan kvantifieras med standardkurvan och standardkurvan.

Eftersom qPCR-tekniken utförs i ett slutet system, minskar sannolikheten för kontaminering och fluorescenssignalen kan övervakas för kvantitativ detektion, så det är den mest använda i klinisk praxis och har blivit den dominerande tekniken inom PCR.

De fluorescerande substanserna som används i realtidsfluorescerande kvantitativ PCR kan delas in i: TaqMan fluorescerande prober, molekylära beacons och fluorescerande färgämnen.

1) TaqMan fluorescerande sond:

Under PCR-amplifiering tillsätts en specifik fluorescerande sond samtidigt som ett par primrar tillsätts.Sonden är en oligonukleotid och de två ändarna är märkta med en reporterfluorescerande grupp respektive en quencher-fluorescerande grupp.

När sonden är intakt absorberas den fluorescerande signalen som emitteras av reportergruppen av den släckande gruppen;under PCR-amplifiering klyver 5'-3' exonukleasaktiviteten hos Taq-enzymet och bryter ner sonden, vilket gör reportern fluorescerande grupp och quencher. Den fluorescerande gruppen separeras, så att fluorescensövervakningssystemet kan ta emot fluorescenssignalen, det vill säga varje gång en DNA-sträng ackumuleras, fluorescerar molekylen och fluorescerar förstärks, cence-signalen är fullständigt synkroniserad med bildningen av PCR-produkten.

2) SYBR fluorescerande färgämnen:

I PCR-reaktionssystemet tillsätts ett överskott av SYBR-fluorescerande färgämne.Efter att SYBR-fluorescerande färgämnet är ospecifikt införlivat i DNA-dubbelsträngen avger det en fluorescerande signal.SYBR-färgämnesmolekylen som inte är inkorporerad i kedjan kommer inte att avge någon fluorescerande signal, vilket säkerställer den fluorescerande signalen. Ökningen av PCR-produkter är helt synkroniserad med ökningen av PCR-produkter.SYBR binder endast till dubbelsträngat DNA, så smältkurvan kan användas för att avgöra om PCR-reaktionen är specifik.

3) Molekylära beacons

Det är en stam-loop dubbelmärkt oligonukleotidsond som bildar en hårnålsstruktur med cirka 8 baser vid 5 och 3 ändarna.Nukleinsyrasekvenserna i båda ändarna är komplementärt parade, vilket gör att den fluorescerande gruppen och den släckande gruppen blir täta.Stäng, det kommer inte att producera fluorescens.

Efter att PCR-produkten har genererats, under hybridiseringsprocessen, paras den mellersta delen av den molekylära beaconen med en specifik DNA-sekvens, och den fluorescerande genen separeras från quenchergenen för att producera fluorescens.

De största nackdelarna med andra generationens PCR:

Känsligheten saknas fortfarande, och detektionen av lågkopierade prover är inte korrekt.

Det finns bakgrundsvärdespåverkan och resultatet är känsligt för störningar.

Tredje generationens digitala PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) beräknar kopietalet för målsekvensen genom slutpunktsdetektion och kan utföra exakt absolut kvantitativ detektion utan att använda interna kontroller och standardkurvor.

Digital PCR använder endpoint-detektion och är inte beroende av Ct-värdet (cykeltröskel), så den digitala PCR-reaktionen påverkas mindre av amplifieringseffektiviteten, och toleransen mot PCR-reaktionshämmare förbättras, med hög noggrannhet och reproducerbarhet.

På grund av egenskaperna för hög känslighet och hög noggrannhet störs den inte lätt av PCR-reaktionshämmare, och den kan uppnå verklig absolut kvantifiering utan standardprodukter, vilket har blivit en forsknings- och tillämpningshotspot.

Beroende på reaktionsenhetens olika former kan den delas in i tre typer: mikrofluidiska, chip- och droppsystem.