Direkt PCR är en reaktion som direkt använder djur- eller växtvävnader för amplifiering utan nukleinsyraextraktion.På många sätt fungerar direkt PCR som vanlig PCR

Huvudskillnaden är den anpassade bufferten som används i direkt PCR, provet kan direkt utsättas för PCR-reaktionen utan nukleinsyraextraktion, men det finns motsvarande krav på toleransen för enzymerna och kompatibiliteten hos bufferten som är involverad i den direkta PCR-reaktionen.

Även om det finns mer eller mindre PCR-hämmare i vanliga prover, kan direkt PCR fortfarande uppnå tillförlitlig amplifiering under inverkan av enzymer och buffertar.Den traditionella PCR-reaktionen kräver högkvalitativ nukleinsyra som mall, vilket kan hämma en smidig utveckling av PCR-reaktionen om mallen innehåller proteiner och andra föroreningar.Direkt PCR är för närvarande en av de mer populära teknologierna inom området molekylär diagnostik.

01 Direct PCR användes ursprungligen för djur och växter

Den tidigaste tillämpningen av direkt PCR är inom området för djur och växter, såsom blod, vävnad och hår från råtta, katt, kyckling, kanin, får, nötkreatur, etc., växtblad och frön, etc., som används för att studera genotypning, transgen, plasmiddetektering, genknockoutanalys, identifiering av DNA-källor, identifiering av arter och andra NP-fält, S.

Dessa fält har några gemensamma egenskaper, det vill säga att målgeninnehållet är relativt högt och nukleinsyraextraktion är besvärlig, så direkt PCR kan inte bara spara tid och ha en liten inverkan på resultaten, utan också spara kostnader.

Direkt PCR som används för att detektera patogener är en fråga för de senaste åren, vissa PCR-reagenstillverkare har gjort mycket ansträngningar i denna riktning när de gör innovation.Speciellt i denna covid-19-epidemi har många sådana detektionsprodukter dykt upp på marknaden, såsom SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) undersökt och utvecklat av Foregene, som använder realtids RT PCR-teknologi (rRT-PCR) för kvalitativ detektering av SARS-Co-harynge- eller svavelsyraprover i svavelsyra eller svavelsyra hos människa. s.

Foregene är ett av företagen som använder Direct PCR-teknologi, för detektering av normal ORF1ab, N, E ochvariant härstamningar av nukleinsyror i humana nasofaryngeala eller orofaryngeala pinnprover såsom SARS-CoV-2 B.1.1.7-linje (UK), B.1.351-linje (ZA), B.1.617-linje (IND) och P.1-linje (BR).

02  Reagens som behövs för direkt PCR

Prov på lysat

Provlysatet kan konfigureras själv eller köpas.Skillnaden i sammansättningen av olika märken av lysat kommer att göra lyseringsförmågan annorlunda, och då blir lyseringstiden något annorlunda.Till exempel, för beredning av djurvävnadsprover, rekommenderas i allmänhet 30 minuter eller över natten lysering, och lyslösningen för virus sträcker sig från 3-10 minuter.

PCR mastermix

Det rekommenderas att använda hot-start DNA-polymeras för att förbättra specifik amplifiering och öka amplifieringsförmågan.Kärnan i direkt PCR är ett mycket tolerant polymeras.

Eliminera eller inhibera komponenter i provet som påverkar DNA-amplifiering

Efter att provet bearbetats med lysatet kommer proteiner, lipider och annat cellskräp att frigöras, dessa substanser kommer att hämma PCR-reaktionen.Därför kräver direkt PCR tillsats av motsvarande avlägsnande eller inhibitorer för att minska inverkan av dessa faktorer.

03  En samling av fem kunskapspunkter för direkt PCR

För det första är Direct PCR-teknologi en direkt PCR-teknik för olika biologiska prover.Under detta tekniska tillstånd finns det inget behov av att separera och extrahera nukleinsyran, direkt använda vävnadsprovet som objekt och lägga till målgenprimrarna för att utföra PCR-reaktionen.

För det andra är Direct PCR-teknologin inte bara en traditionell DNA-mallamplifieringsteknologi, utan inkluderar också RNA-mall omvänd transkriptions-PCR.

För det tredje utför Direct PCR-teknologin inte bara direkt rutinmässiga kvalitativa PCR-reaktioner på vävnadsprover, utan inkluderar även realtids-qPCR-reaktioner, vilket kräver att reaktionssystemet har stark anti-bakgrundsfluorescensinterferensförmåga och endogen fluorescens släcker den antagonistiska förmågan.

För det fjärde behöver proverna som riktas till Direct PCR-teknologin bara frigöras av nukleinsyramallar och tar inte bort proteiner, polysackarider, saltjoner etc. som stör PCR-reaktionen.Vilket kräver att nukleinsyrapolymeraset och PCR Mix i reaktionssystemet har utmärkt resistens och anpassningsförmåga för att säkerställa enzymaktivitet och replikationsnoggrannhet under komplexa förhållanden.

För det femte är vävnadsprovet riktat till Direct PCR-teknologi utan någon nukleinsyraanrikningsbehandling och mängden mall är mycket liten, vilket kräver att reaktionssystemet har extremt hög känslighet och amplifieringseffektivitet.