Jag tror att alla alltid kommer att stöta på sådana eller sådana problem när de gör PCR-reaktioner, men de flesta av dem kan klassificeras i två huvudproblem:

För lite amplifiering av genmallen (amplifiering);
För mycket icke-målgenamplifiering.
Att använda tillsatser är en av de vanligaste strategierna för att lösa dessa problem.Vanligtvis har tillsatsernas roll två aspekter:
sekundär strukturav gener (sekundär struktur);
Minska ospecifik priming.
Idag kommer redaktören kort att presentera de vanliga tillsatserna i PCR-reaktioner och deras funktioner.
Tillsatser som minskar sekundär struktur
sulfoxid(DMSO)
genprovermed högt GC-innehåll.Emellertid minskar DMSO också avsevärt Taq-polymerasaktivitet.Därför måste alla balansera malltillgängligheten och polymerasets aktivitet.Redaktören föreslår att du kan prova olika koncentrationer av DSMO, till exempel från 2 % till 10 %, för att hitta den koncentration som passar ditt experiment.
Icke-joniska tvättmedel
Nonjoniska detergenter, såsom 0,1-1 % Triton X-100, Tween 20 eller NP-40, reducerar vanligtvis DNA-sekundärstrukturen.Även om detta kan öka amplifieringen av mallgenen, kommer det också att orsaka problem med icke-specifik amplifiering.Så dessa tillsatser fungerar bra för PCR-reaktioner med låg avkastning utan skräp, men inte så bra för relativt orena PRC-reaktioner.En annan fördel med icke-joniska tvättmedel är minskningen av SDS-kontamination.Vanligtvis under DNA-extraktionsprocessen kommer SDS att föras till PCR-steget, vilket kraftigt hämmar aktiviteten hos polymeraset.Därför kan tillsats av 0,5 % Tween-20 eller Tween-40 till reaktionen neutralisera de negativa effekterna av SDS.
Betain_
Betain kan förbättra DNA-amplifiering genom att minska bildningen av sekundär struktur och är i allmänhet ett "mysterium" tillägg till kommersiella PCR-kit.Om du vill använda betain ska du lägga betain eller betainmonohydrat (Betain eller Betainmonohydrat), men inte betainhydroklorid (Betain HCl), justera till en slutkoncentration på 1-1,7M.Betain kan också bidra till att förbättra specificiteten eftersom det eliminerar basparets sammansättningsberoende av DNA-smältning/DNA-denaturering.
Tillsatser för att minska ospecifik grundning
Formamid
Formamid är en vanlig organisk PCR-tillsats.Det kan kombineras med större spår och mindre spår i DNA, vilket minskar stabiliteten hos master-DNA-dubbelhelixen och sänker smälttemperaturen för DNA.Koncentrationen av formamid som används i PCR-experiment är vanligtvis 1%-5%.
Tetrametylammoniumklorid( TMAC)
Tetrametylammoniumklorid kan öka specificiteten för hybridisering (hybridiseringsspecificitet) och öka smälttemperaturen för DNA.Således kan TMAC ta bort ospecifik priming och minska felbindning av DNA och RNA.Om du använderdegenererade primersi PCR-reaktionen, kom ihåg att lägga till TMAC, som vanligtvis används i en koncentration av 15-100 mM.
Andra vanliga tillsatser
Förutom de två kategorierna av tillsatser som nämns ovan finns det många vanliga tillsatser i PCR-reaktioner, även om de har olika funktioner är de också mycket viktiga.
Magnesiumjon
Magnesiumjon är en oumbärlig kofaktor (kofaktor) av polymeras, det vill säga utan magnesiumjon är polymeras inaktivt.Men för mycket magnesiumjoner kan också påverka polymerasets effektivitet.Koncentrationen av magnesiumjoner i varje PCR-reaktion kommer att variera.Kelateringsmedel (som EDTA eller citrat), koncentrationen av dNTP och proteiner påverkar alla koncentrationen av magnesiumjoner.Så om du har problem med ditt PCR-experiment kan du försöka ändra olika magnesiumjonkoncentrationer, till exempel från 1,0 till 4,0 mM, med ett intervall på 0,5–1 mM emellan.
Det är värt att notera att flera frys-upptiningscykler kan leda till koncentrationsskiktning av magnesiumkloridlösningen.Därför måste du lösa det helt före varje användning, och blanda det väl innan du använder det.
Bovint serumalbumin(Bovint albumin, BSA)
I molekylärkemiexperiment är bovint serumalbumin en mycket vanlig tillsats, speciellt i restriktionsenzymdigestion och PCR-experiment.I PCR-reaktioner är BSA till hjälp för att minska föroreningar som fenolföreningar.Och det sägs också att det kan minska vidhäftningen av reaktanter till provrörets vägg.I PCR-reaktionen kan vanligtvis koncentrationen av tillsatt BSA nå 0,8 mg/ml.
 
Relaterade produkter:
PCR-hjälte(med färg)
PCR-hjälte