Författare: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Enhet: Jiaozhou-sjukhuset, Dongfang-sjukhuset, knutet till Tongji-universitetet

För närvarande är den huvudsakliga provtypen för detektion av respiratorisk patogen nukleinsyra svalg.Det finns många typer av vanliga provkonserveringslösningar, som alla måste kylas eller frysas för transport och lagring;Det är svårt att kontrollera hela processen med låg temperatur under insamlings- och transportprocessen, och det är svårt att säkerställa kvalitetskontrollen före provtestning^[1-2].

RNase (RNase) är ett endonukleas som hydrolyserar RNA, huvudsakligen som bryter fosfodiesterbindningar mellan nukleotider.RNas-molekylen är mycket stabil, det finns disulfidbindningar i strukturen och dess aktivitet kräver inte närvaron av tvåvärda katjoner, så RNas är inte lätt att denaturera och det är lätt att renaturera även efter hög temperatur eller användning av denatureringsmedel.RNaser delas in i endogena och exogena.De endogena RNaserna kan frisättas samtidigt när cellerna spricker.Därför är eliminering av rollen för endogena RNaser ett mycket kritiskt steg i RNA-extraktionsprocessen.Exogena RNaser är vitt spridda.RNaser finns i luften, mänsklig hud, hår och saliv, vilket är viktiga orsaker till den lätta nedbrytningen av RNA^[3].

Datafråga

CANS-CL02-A009 "Tillämpning av riktlinjer för medicinsk laboratoriekvalitet och kompetensackreditering inom området för molekylär diagnostik" i de tekniska kraven föreslår att lämpliga vattenkvalitetsstandarder ska formuleras i enlighet med applikationen;Lufttäta engångsbehållare:

RNase/klassificering

(1) RNas A

Ribonukleas A (RNas A), härrörande från bovin pankreas, är ett endoribonukleas som specifikt kan attackera 3'-änden av pyrimidinrester på RNA, skära av cytosin eller uracil som bildas av intilliggande nukleotider.Fosfodiesterbindning, slutprodukten av reaktionen är en 3′ pyrimidinnukleotid och en oligonukleotid med en 3′ pyrimidinnukleotid i slutet.

(2) RNas TI

Ribonukleas T1 (RNase T1) härrör från Aspergillus orjzae, det verkar specifikt på det 3'-terminala fosfatet av guanin, och klyvningsstället är mellan 3'-fosfatet hos guanin och 5'-hydroxylen i intilliggande nukleotider.Slutprodukten av reaktionen är 3'guanylsyra och oligonukleotidfragment med 3'guanylsyra i slutet.

(3) RNas H

Ribonukleas H (RNase H) upptäcktes först från kalvtymusvävnad och dess kodande gen har klonats in i Escherichia coli.Det kan specifikt bryta ner DNA: RNA-strängar i RNA-hybridduplex, vilket resulterar i oligonukleotider och mononukleotider med 3'-OH och 5'-monofosfatändar, det kan inte bryta ned enkel- eller dubbelsträngat DNA eller RNA.

RNase

Funktion och användning

Ribonukleas kan katalysera nedbrytningen av ribonukleinsyra (RNA) och kan syntetiseras artificiellt.Medicinsk salva används lokalt för att behandla trauma och ledvärk.Enligt rapporter kan ribonukleas förändra värdcellens metabolism, hämma virussyntes, hämma spridningen av influensavirus in vitro och hämma bildandet av vaccinia- och herpesvirus i kycklingembryon.Klinisk användning av ribonukleas daglig intramuskulär injektion av 180 mg, fördelaktig för behandling av epidemisk encefalit, ribonukleas kan katalysera nedbrytningen av ribonukleinsyra (RNA), och kan nu syntetiseras på konstgjord väg.Medicinsk salva används lokalt för att behandla trauma och ledvärk.Enligt rapporter kan ribonukleas förändra värdcellens metabolism, hämma virussyntes, hämma spridningen av influensavirus in vitro och hämma bildandet av vaccinia- och herpesvirus i kycklingembryon.Klinisk användning av ribonukleas daglig intramuskulär injektion på 180 mg är fördelaktig för behandling av epidemisk encefalit.

RNase

Inhibitor Definition

Definition av RNas-inhibitorenhet: Mängden enzym som krävs för att hämma 50 % av aktiviteten hos 5ng RNas A är en enhet.

Hur RNas-hämmare fungerar

Guanidin isotiocyanat:

Guanidin isotiocyanat är en organisk förening med molekylformeln C2H6N4S.Används huvudsakligen inom biologisk medicin, kemiska reagens, etc. Guanidin isotiocyanat är ett proteinlyserande medel, och det används ofta som huvudkomponenten i lyslösning i molekylär diagnostiska reagens.Det kan lysera vävnad, förstöra cellstruktur och dissociera nukleinsyra från nukleoprotein och har stark denaturering till RNas.Det är den mest effektiva RNas-hämmaren för närvarande.

TRIzol är ett nytt total-RNA-extraktionsreagens som direkt kan extrahera totalt RNA från celler eller vävnader.Den innehåller ämnen som fenol och guanidin isotiocyanat, som snabbt kan störa celler och hämma nukleaser som frigörs av celler.

(Men guanidin isotiocyanat är farligt för labbforskarnas hälsa.)

RNAsin:

Surt glykoprotein extraherat från råttlever eller human blastoderm.Rnasin är en icke-kompetitiv hämmare av RNas, som kan binda till olika RNaser för att inaktivera dem.

(Mer information: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hhög temperatur:

Hög temperatur är också ett vanligt sätt för proteindenaturering.

Dietylpyrokarbonat (DEPC):

DEPC är en stark men ofullständig RNas-hämmare, som kan hämma RNas-aktivitet genom att kombinera med aminosyra-imidazolringen i den aktiva RNase-gruppen för att denaturera proteiner.

Vanadylribonukleosidkomplex:

Ett komplex bildat av vanadinoxidjoner och nukleosider, som binder till RNas i form av övergångsämnen, vilket nästan helt kan hämma aktiviteten av RNas

Övrig:

SDS, urea, kiselgur etc. har också en viss hämmande effekt på RNas.

Expertrecensioner

Li Yujie chefstekniker

Direktör för laboratorieavdelningen, Jiaozhou-sjukhuset, Dongfang-sjukhuset, anslutet till Tongji-universitetet

För att förhindra biologisk nedbrytning av exogent RNas bör masker, handskar och mössor bäras och bytas ut ofta under RNA-extraktionsprocessen.Alla glasföremål måste gräddas i torkugn vid 200°C i mer än 2 timmar.Material som används för bakning, såsom plast, måste behandlas med DEPC-vatten och sedan tvättas med destillerat vatten.Reagenserna eller enheterna som används för extraktion, konservering och identifiering av RNA bör dedikeras till RNA, och ett oberoende RNA-operationsområde bör inrättas.

referenser:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterier och virus i nasofarynx omedelbart före uppkomsten av akuta nedre luftvägsinfektioner hos inhemska australiensiska barn[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.

[2] Hospital Infection Control Branch of Chinese Preventive Medicine Association.Riktlinjer för insamling och inspektion av kliniska mikrobiella prover [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] "Kliniskt test Ten Thousand Why Molecular Biology Test Volume"