Traditionella omvända transkriptaser kan inte tolerera höga temperaturer (den optimala temperaturen för MMLV-aktivitet är 37-50°C och AMV är 42-60°C).Det mer komplexa virala RNA:t kan inte effektivt omvänt transkriberas till cDNA vid låga temperaturer, vilket resulterar i detektionseffektivitet. Reduktionen.Traditionell RT-qPCR kräver i allmänhet deltagande av två nyckelenzymer (omvänt transkriptas och DNA-polymeras), vilket gör det omöjligt att förenkla driften av reaktionssystemet och minska kostnaderna.Här kommer vi att introducera två högtemperaturresistenta omvända transkriptaser, TtH och RevTaq.Dessa två enzymer har också funktionen av DNA-polymeras, så de kallas bifunktionella enzymer.
TtH DNA-polymeras
Du måste ha hört talas om TtH, som kommer från den termofila bakterien Thermus thermophilus HB8.I närvaro av tvåvärda katjoner såsom Mg2+ har den DNA-polymerasaktivitet.Det används ofta i PCR-reaktioner som Taq-enzym, men det har högre värmebeständighet än Taq-enzym, så det har också en bättre effekt på PCR med mallar med högt GC-innehåll.
· Detta enzym har i princip ingen 3′→5′ exonukleasaktivitet och 5′→3′ exonukleasaktivitet, så det kan också användas för dideoxisekvensering.
· Detta enzym har RTase-aktivitet.I närvaro av Mn2+ kommer RTase-aktiviteten att ökas.Genom att använda denna funktion kan den användas för att utföra omvänd transkriptionsreaktion och PCR-reaktion i samma rör, det vill säga enstegs RT-PCR.Men i närvaro av Mn2+ är noggrannheten för RT-PCR inte hög.RT-aktivitet har ingenting att göra med rnaas H-aktivitet.
· Den ökade aktiviteten hos Tth-DNA-polymeras (pH9, optimum +55℃~+70℃, maximalt +95℃) övervinner de problem som orsakas av RNA:s sekundära struktur.Det resulterande cDNA:t kan amplifieras med PCR med samma enzym i närvaro av Mg2+-joner.
· Förmågan hos Tth-DNA-polymeras att utföra omvänd transkription och DNA-amplifiering vid höga temperaturer gör detta enzym användbart för kvantitativ RT-PCR, kloning och genuttrycksanalys av cellulärt och viralt RNA.
· Tth-DNA-polymeras används för RT-PCR för att amplifiera RNA upp till 1 kb.
Egenskaper och fördelar
Tth DNA-polymeras:
• Säkerställ produktstorleken för den optimerade polymeraskedjereaktionen (PCR), minst 1000 bp i RT-PCR-reaktionen
• Acceptera modifierat deoxiribonukleosidtrifosfat som substrat
• Ej relaterat till RNase H-aktivitet
• Har hög termisk stabilitet för att övervinna problem, vanligtvis relaterade till den höga sekundära strukturen som finns i RNA
RevTaq RT-PCR DNA-polymeras
Ett värmebeständigt DNA-polymeras med omvänd transkriptasaktivitet
RevTaq-RT-PCR-DNA-polymeras är ett konstruerat, mycket värmebeständigt, dubbelfunktionellt enzym med omvänt transkriptas och DNA-polymerasaktiviteter erhållna genom riktad och artificiell evolution.
· Halveringstiden för RevTaq RT-PCR DNA-polymeras vid 95°C är längre än 40 minuter.
· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras möjliggör omvänd transkription vid hög temperatur direkt från RNA-mallen, och steget för omvänd transkription kan upprepas flera gånger för att generera fler cDNA-mallar.
· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras tillåter "nollstegs" RT-PCR (inget isotermiskt omvänd transkriptionssteg), eftersom i det cykliska PCR-förlängningssteget sker omvänd transkription och DNA-amplifiering samtidigt.Detta främjar också den omvända transkriptionsreaktionen vid höga temperaturer, och minimerar därigenom problemen som uppstår vid smältning av den starka sekundära strukturen i RNA vid höga temperaturer.
· På grund av den aptamerbaserade varmstartformeln ger RevTaq RT-PCR DNA-polymeras bättre resultat när hybridiserings- och förlängningstemperaturen är högre än 57°C.
· Eftersom enzymet är värmebeständigt rekommenderas det att designa primers och prober med mycket höga smältpunkter (>60°C).
· Det rekommenderas att optimera temperaturen för glödgnings-/förlängningssteget genom en temperaturgradient under reaktionsinställningsprocessen.
· Ju högre temperatur, desto högre specificitet för PCR.Den omvända transkriptionscykeln utförs vanligtvis vid en högre temperatur än PCR-cykeln, eftersom DNA Primer:RNA-mallhybridisering vanligtvis har en högre smältpunkt än DNA Primer:cDNA-mallduplex.
· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras är genmanipulerat och optimerat, och amplikonstorleken är mellan 60-300 bp.
RevTaq RT-PCR DNA-polymerasdetektionsgräns når 4 kopior/
Det optimerade reaktionssystemet (upprättandet av primers med hög smältpunkt) visas i figuren.RevTaq RT-PCR DNA-polymerasdriven RT-PCR visar bättre känslighet än TaqPath 1-stegs RT-qPCR mastermix och lägre detektionsgradient för provspädning.
Fler fördelar:
Snabbstartsfunktion → Det första termiska denatureringssteget kan hoppas över.
Hot-start aptamer formula → Tillhandahåll 100 % enzymaktivitet omedelbart och förhindra ospecifik amplifiering vid låga temperaturer (<57°C).
Klyvningsfunktion → RNA-extraktionssteget utelämnas eftersom RevTaq RT-PCR DNA-polymeras också kan bearbeta råa reaktionsprover.Det kan omedelbart förstöra cellmembranen hos eukaryoter, bakterier och virus i en het RT-PCR-cykel.
IVD-råvarunivå → hög kvalitetsstandard och extremt konkurrenskraftiga priser
Posttid: 2021-aug-12