• Facebook
  • linkedin
  • Youtube

Traditionella omvända transkriptaser kan inte tolerera höga temperaturer (den optimala temperaturen för MMLV-aktivitet är 37-50°C och AMV är 42-60°C).Det mer komplexa virala RNA:t kan inte effektivt omvänt transkriberas till cDNA vid låga temperaturer, vilket resulterar i detektionseffektivitet. Reduktionen.Traditionell RT-qPCR kräver i allmänhet deltagande av två nyckelenzymer (omvänt transkriptas och DNA-polymeras), vilket gör det omöjligt att förenkla driften av reaktionssystemet och minska kostnaderna.Här kommer vi att introducera två högtemperaturresistenta omvända transkriptaser, TtH och RevTaq.Dessa två enzymer har också funktionen av DNA-polymeras, så de kallas bifunktionella enzymer.

TtH DNA-polymeras

Du måste ha hört talas om TtH, som kommer från den termofila bakterien Thermus thermophilus HB8.I närvaro av tvåvärda katjoner såsom Mg2+ har den DNA-polymerasaktivitet.Det används ofta i PCR-reaktioner som Taq-enzym, men det har högre värmebeständighet än Taq-enzym, så det har också en bättre effekt på PCR med mallar med högt GC-innehåll.

· Detta enzym har i princip ingen 3′→5′ exonukleasaktivitet och 5′→3′ exonukleasaktivitet, så det kan också användas för dideoxisekvensering.

· Detta enzym har RTase-aktivitet.I närvaro av Mn2+ kommer RTase-aktiviteten att ökas.Genom att använda denna funktion kan den användas för att utföra omvänd transkriptionsreaktion och PCR-reaktion i samma rör, det vill säga enstegs RT-PCR.Men i närvaro av Mn2+ är noggrannheten för RT-PCR inte hög.RT-aktivitet har ingenting att göra med rnaas H-aktivitet.

· Den ökade aktiviteten hos Tth-DNA-polymeras (pH9, optimum +55℃~+70℃, maximalt +95℃) övervinner de problem som orsakas av RNA:s sekundära struktur.Det resulterande cDNA:t kan amplifieras med PCR med samma enzym i närvaro av Mg2+-joner.

· Förmågan hos Tth-DNA-polymeras att utföra omvänd transkription och DNA-amplifiering vid höga temperaturer gör detta enzym användbart för kvantitativ RT-PCR, kloning och genuttrycksanalys av cellulärt och viralt RNA.
· Tth-DNA-polymeras används för RT-PCR för att amplifiera RNA upp till 1 kb.

null
 

Egenskaper och fördelar

Tth DNA-polymeras:

• Säkerställ produktstorleken för den optimerade polymeraskedjereaktionen (PCR), minst 1000 bp i RT-PCR-reaktionen

• Acceptera modifierat deoxiribonukleosidtrifosfat som substrat

• Ej relaterat till RNase H-aktivitet

• Har hög termisk stabilitet för att övervinna problem, vanligtvis relaterade till den höga sekundära strukturen som finns i RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polymeras

Ett värmebeständigt DNA-polymeras med omvänd transkriptasaktivitet

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymeras är ett konstruerat, mycket värmebeständigt, dubbelfunktionellt enzym med omvänt transkriptas och DNA-polymerasaktiviteter erhållna genom riktad och artificiell evolution.

· Halveringstiden för RevTaq RT-PCR DNA-polymeras vid 95°C är längre än 40 minuter.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras möjliggör omvänd transkription vid hög temperatur direkt från RNA-mallen, och steget för omvänd transkription kan upprepas flera gånger för att generera fler cDNA-mallar.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras tillåter "nollstegs" RT-PCR (inget isotermiskt omvänd transkriptionssteg), eftersom i det cykliska PCR-förlängningssteget sker omvänd transkription och DNA-amplifiering samtidigt.Detta främjar också den omvända transkriptionsreaktionen vid höga temperaturer, och minimerar därigenom problemen som uppstår vid smältning av den starka sekundära strukturen i RNA vid höga temperaturer.

· På grund av den aptamerbaserade varmstartformeln ger RevTaq RT-PCR DNA-polymeras bättre resultat när hybridiserings- och förlängningstemperaturen är högre än 57°C.

· Eftersom enzymet är värmebeständigt rekommenderas det att designa primers och prober med mycket höga smältpunkter (>60°C).

· Det rekommenderas att optimera temperaturen för glödgnings-/förlängningssteget genom en temperaturgradient under reaktionsinställningsprocessen.

· Ju högre temperatur, desto högre specificitet för PCR.Den omvända transkriptionscykeln utförs vanligtvis vid en högre temperatur än PCR-cykeln, eftersom DNA Primer:RNA-mallhybridisering vanligtvis har en högre smältpunkt än DNA Primer:cDNA-mallduplex.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeras är genmanipulerat och optimerat, och amplikonstorleken är mellan 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA-polymerasdetektionsgräns når 4 kopior/Två (2)

Det optimerade reaktionssystemet (upprättandet av primers med hög smältpunkt) visas i figuren.RevTaq RT-PCR DNA-polymerasdriven RT-PCR visar bättre känslighet än TaqPath 1-stegs RT-qPCR mastermix och lägre detektionsgradient för provspädning.

Fler fördelar:

Snabbstartsfunktion → Det första termiska denatureringssteget kan hoppas över.

Hot-start aptamer formula → Tillhandahåll 100 % enzymaktivitet omedelbart och förhindra ospecifik amplifiering vid låga temperaturer (<57°C).

Klyvningsfunktion → RNA-extraktionssteget utelämnas eftersom RevTaq RT-PCR DNA-polymeras också kan bearbeta råa reaktionsprover.Det kan omedelbart förstöra cellmembranen hos eukaryoter, bakterier och virus i en het RT-PCR-cykel.

IVD-råvarunivå → hög kvalitetsstandard och extremt konkurrenskraftiga priser


Posttid: 2021-aug-12