Flera revolutionerande uppfinningar i detektionsteknologins historia i mitt sinne är immunmärkningsteknologi baserad på principen om antigen-antikroppsspecifik bindning, PCR-teknologi och sekvenseringsteknologi.Idag ska vi prata om PCR-teknik.Enligt utvecklingen av PCR-tekniken delar människor in PCR-tekniken i tre generationer: vanlig PCR-teknik, realtidsfluorescerande kvantitativ PCR-teknik och digital PCR-teknik.
Callmän PCR-teknik
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis uppfann polymeraskedjereaktionen (polymeraskedjereaktion , PCR) 1983. Det sägs att när han körde sin flickvän fick han plötsligt en blixt av inspiration och tänkte på principen om PCR (om fördelarna med att köra bil).Kary Mullis tilldelades Nobelpriset i kemi 1993. New York Times kommenterade: "Mycket originell och betydelsefull, nästan indelning av biologi i pre-PCR och post-PCR-epoker.
Principen för PCR: Under katalys av DNA-polymeras används modersträngens DNA som mall, och den specifika primern används som utgångspunkt för förlängningen, och dottersträngens DNA som är komplementär till modersträngens mall-DNA kopieras in vitro genom denaturering, hybridisering, förlängning och andra steg.Det är en DNA-syntesförstärkningsteknologi in vitro, som snabbt och specifikt kan amplifiera vilket mål-DNA som helst in vitro.
Fördelar med vanlig PCR
1.Klassisk metod, komplett internationella och inhemska standarder
2.Lägre kostnad för instrumentreagens
3.PCR-produkter kan återvinnas för andra molekylärbiologiska experiment
Rekommenderad Foregene PCR-maskin: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Relaterade produkter: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nackdelar med vanlig PCR
1.lätt att förorena
2.besvärlig operation
3.endast kvalitativ analys
4.Måttlig känslighet
5.Det finns ospecifik amplifiering, och när det ospecifika bandet har samma storlek som målbandet kan det inte särskiljas
Capillär elektroforesbaserad PCR
Som svar på bristerna med vanlig PCR har vissa tillverkare introducerat instrument baserade på principen om kapillärelektrofores.Elektroforessteget efter PCR-amplifiering är avslutat i kapillären.Känsligheten är högre, och skillnaden mellan flera baser kan urskiljas och förstärkningen kan beräknas av MAERKER.produktinnehåll.Nackdelen är att PCR-produkten fortfarande behöver öppnas och sättas in i instrumentet, och det finns fortfarande stor risk för kontaminering.
CapillärElektrofores
2. Realtidsfluorescerande kvantitativ PCR-teknik (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescerande kvantitativ PCR, även kallad Real-Time PCR, är en ny kvantitativ nukleinsyrateknologi utvecklad av PE (Perkin Elmer) 1995. Utvecklingshistorien för fluorescerande kvantitativ PCR är en historia av själsrörande kamper av jättar som ABI, Roche och Bio-Rad.Om du är intresserad kan du kolla in det.Denna teknik är för närvarande den mest mogna och mest använda semikvantitativa PCR-tekniken.
Rekommenderad qPCR-maskin: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescerande färgningsmetod (SYBR Green I):SYBR Green I är det vanligaste DNA-bindande färgämnet för kvantitativ PCR, som binder ospecifikt till dubbelsträngat DNA.I det fria tillståndet avger SYBR Green svag fluorescens, men när den väl är bunden till dubbelsträngat DNA ökar dess fluorescens 1000 gånger.Därför är den totala fluorescerande signalen som emitteras av en reaktion proportionell mot mängden dubbelsträngat DNA som finns närvarande och kommer att öka med ökningen av amplifierad produkt.Eftersom färgämnet binder ospecifikt till dubbelsträngat DNA, kan falskt positiva resultat genereras.
Relaterade produkter: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescerande sondmetod (Taqman-teknologi): UnderPCR-amplifiering, en specifik fluorescerande sond tillsätts samtidigt som ett par primrar.Sonden är en linjär oligonukleotid, med en fluorescerande reportergrupp respektive en fluorescerande quencher-grupp märkta i båda ändar.När sonden är intakt absorberas den fluorescerande signalen som sänds ut av reportergruppen av quenchergruppen, och detektionen Det finns ingen fluorescerande signal;under PCR-amplifiering (i förlängningssteget) kommer 5'-3' Dicer-aktiviteten av Taq-enzymet att smälta och bryta ned sonden, så att reporterfluorescensgruppen och quencher-fluorescensgruppen separeras, så att fluorescensövervakningssystemet. Den fluorescerande signalen kan tas emot, det vill säga varje gång en DNA-kedja förstärks för att fullfölja molekylen av fluorescerande molekyler, vilken fluorescerande molekylen förstärks. bildning av fluorescerande signaler och bildandet av PCR-produkter.Taqman-probmetoden är den mest använda detektionsmetoden inom klinisk detektion.
Relaterade produkter: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Fördelar med qPCR
1.Metoden är mogen och den stödjande utrustningen och reagenserna är kompletta
2.Medium kostnad för reagens
3.lätt att använda
4.Hög detektionskänslighet och specificitet
Nackdelar med qPCR
Mutationen av målgenen leder till missad upptäckt.
Detekteringsresultatet av mall med låg koncentration kan inte fastställas.
Det finns ett stort fel vid användning av standardkurvan för kvantitativ detektion.
3. Digital PCR-teknik (digital PCR, dPCR).
Digital PCR är en teknik för absolut kvantifiering av nukleinsyramolekyler.Jämfört med qPCR kan digital PCR direkt avläsa antalet DNA/RNA-molekyler, vilket är den absoluta kvantifieringen av nukleinsyramolekyler i startprovet.1999 föreslog Bert Vogelstein och Kenneth W. Kin-zler formellt konceptet dPCR.
2006 var Fluidigm först med att producera ett kommersiellt chipbaserat dPCR-instrument.2009 lanserade Life Technologies OpenArray och QuantStudio 12K Flex dPCR-systemen.2013 lanserade Life Technologies QuantStudio 3DdPCR-systemet, som använder högdensitetsmikrofluidchipteknologi i nanoskala för att jämnt fördela prover till 20 000 individuella celler.i reaktionsbrunnen.
2011 lanserade Bio-Rad det droppbaserade QX100 dPCR-instrumentet, som använder vatten-i-olja-teknik för att jämnt fördela provet till 20 000 droppar-vatten-i-olja, och använder en droppanalysator för att analysera dropparna.2012 lanserade RainDance instrumentet RainDrop dPCR, som drivs av högtrycksgas, för att dela upp varje standardreaktionssystem i en reaktionsemulsion innehållande 1 miljon till 10 miljoner mikrodroppar på pikoliternivå.
Hittills har digital PCR bildat två stora fraktioner, chiptyp och dropptyp.Oavsett vilken typ av digital PCR är dess kärnprinciper begränsning av utspädning, endpoint PCR och Poisson-distribution.Det vanliga PCR-reaktionssystemet som innehåller nukleinsyramallar är jämnt uppdelat i tiotusentals PCR-reaktioner, som distribueras till chips eller mikrodroppar, så att varje reaktion innehåller så mycket som möjligt en mallmolekyl och en PCR-reaktion med en enmolekyls mall utförs.Genom att avläsa fluorescensen. Närvaron eller frånvaron av signalen räknas, och den absoluta kvantifieringen utförs efter kalibrering av den statistiska Poisson-fördelningen.
Följande är egenskaperna hos flera digitala PCR-plattformar som jag har använt:
1. Bio-Rad QX200 droppe digital PCR Bio-RadQX200 är en mycket klassisk digital PCR-plattform, den grundläggande detektionsprocessen: 20 000 prover genereras av droppgeneratorn Vatten-i-olja mikrodroppar förstärks på en vanlig PCR-maskin, och slutligen läses fluorescenssignalen för varje mikrodropp av en mikrodroppläsare.Verksamheten är mer komplicerad och risken för föroreningar medelhög.
Xinyi TD1 mikrodroppar digital PCRXinyi TD1 är en inhemsk digital PCR-plattform, den grundläggande detekteringsprocessen: generera 30 000-50 000 vatten-i-olja-droppar genom en droppgenerator, förstärka på ett vanligt PCR-instrument och slutligen passera. Droppläsaren läser den fluorescerande signalen för varje droppe.Både generering av droppar och avläsning i denna plattform utförs i ett dedikerat chip med låg risk för kontaminering.
STILLA Naica mikrodroppchip digital PCRSTILLA Naica är en relativt ny digital PCR-plattform.Den grundläggande detekteringsprocessen är: lägg till reaktionslösningen till chipet, lägg chipet i mikrodroppargenererings- och amplifieringssystemet och generera 30 000 mikrodroppar.Sprid på chipet, och PCR-förstärkning slutförs på chipet.Sedan överförs det förstärkta chippet till analyssystemet för mikrodroppar och den fluorescerande signalen avläses genom att ta bilder.Eftersom hela processen sker i ett slutet chip är risken för kontaminering låg.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D-chip digital PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D är en annan klassisk chipbaserad digital PCR-plattform.Dess grundläggande detekteringsprocess är: tillsätt reaktionslösningen i spridaren och sprid reaktionslösningen jämnt på chipet med 20 000 mikrobrunnar genom spridaren., sätt chippet på PCR-maskinen för att förstärka, och sätt slutligen chipet i läsaren och ta ett foto för att läsa den fluorescerande signalen.Operationen är relativt komplicerad, och hela processen utförs i ett slutet chip, och risken för kontaminering är låg.
5. JN MEDSYS Clarity chip digital PCR
JN MEDSYS Clarity är en relativt ny digital PCR-plattform av chiptyp.Dess grundläggande detektionsprocess är: tillsätt reaktionslösningen i applikatorn och sprid reaktionslösningen jämnt på 10 000 PCR-rör fixerade i PCR-röret genom applikatorn.På det mikroporösa chippet kommer reaktionslösningen in i chipet genom kapillärverkan, och PCR-röret med chipet placeras på PCR-maskinen för amplifiering, och slutligen sätts chipet in i läsaren för att läsa den fluorescerande signalen genom att ta ett foto.Operationen är mer komplicerad.Risken för kontaminering är låg.
Parametrarna för varje digital PCR-plattform sammanfattas enligt följande:
Utvärderingsindikatorerna för den digitala PCR-plattformen är: antalet delade enheter, antalet fluorescerande kanaler, komplexiteten i driften och risken för kontaminering.Men det viktigaste är detektionsnoggrannheten.Ett sätt att utvärdera digitala PCR-plattformar är att använda flera digitala PCR-plattformar för att verifiera varandra, och ett annat sätt är att använda standardämnen med korrekta värden.
Fördelar med dPCR
1.Att uppnå absolut kvantifiering
2.Högre sensitivitet och specificitet
3.Kan upptäcka lågkopierade prover
Nackdelar med dPCR1. Dyr utrustning och reagens 2. Komplicerad drift och lång detektionstid 3. Snävt detektionsområde
För närvarande har de tre generationerna av PCR-teknik sina egna fördelar och nackdelar, och var och en har sina egna applikationsområden, och det är inte ett förhållande att en generation ersätter den andra.Den ständiga utvecklingen av teknologin har injicerat ny vitalitet i PCR-tekniken, vilket gör det möjligt för den att låsa upp den ena applikationsriktningen efter den andra, vilket gör nukleinsyradetektion mer bekväm och exakt.
Källa: Dr. Yuan tar dig för testning
Rekommenderade produkter:
Posttid: 2022-nov-18
