PCR är den mest använda nukleinsyraamplifieringsteknologin och används ofta på grund av dess känslighet och specificitet.Men PCR kräver upprepad termisk denaturering och kan inte bli av med begränsningarna med att förlita sig på instrument och utrustning, vilket begränsar dess tillämpning i kliniska fälttester.

Sedan början av 1990-talet har många laboratorier börjat utveckla teknik för konstant temperaturförstärkning som inte kräver termisk denaturering.Nu har de utvecklat loop-medierad isotermisk amplifieringsteknologi, strängersättning isotermisk amplifieringsteknologi, rolling circle isoterm amplifieringsteknologi och nukleinsyrasekvensberoende.Isotermisk förstärkningsteknik och andra tekniker. 

Loop-medierad isoterm förstärkning

Amplifieringsprincipen är baserad på det faktum att DNA är i ett dynamiskt jämviktstillstånd vid ca 65°C.När någon primer basparas och förlängs till den komplementära delen av dubbelsträngat DNA, kommer den andra strängen att dissociera och bli enkelsträngad.

Vid denna temperatur använder DNA 4 specifika primrar för att förlita sig på ett DNA-polymeras med strängförskjutning för att få syntesen av strängförskjutnings-DNA att självcirkulera kontinuerligt.

Bestäm först de 6 specifika regionerna F3, F2, F1, B1, B2, B3 på målgenen och designa sedan 4 primers baserat på dessa 6 specifika regioner (som visas i figuren nedan):

Den främre inre primern (FIP) består av F1c och F2.

Den bakåtriktade inre primern (BIP) är sammansatt av B1c och B2, och TTTT används som en spacer i mitten.

De yttre primrarna F3 och B3 är sammansatta av F3- respektive B3-regioner på målgenen.

I LAMP-reaktionssystemet är koncentrationen av den inre primern flera gånger den för den yttre primern.Den inre primern kombineras först med mallsträngen för att syntetisera en komplementär sträng för att bilda en DNA-dubbelsträng.Därefter kombineras den yttre primern med mallsträngen för att bilda en DNA-dubbelsträng.Under verkan av BstDNA-polymeras frisätts den komplementära strängen som syntetiseras av den inre primern.Efter en serie reaktioner bildar den komplementära strängen slutligen en enda DNA-sträng med en hantelstruktur.

Hantelstruktur-DNA-enkelsträngen i sig används som en mall för att kontinuerligt bilda ett övergångsstam-öglestruktur-DNA med en öppen ände.De inre och yttre primrarna styr DNA:t med övergångsstam-loopstrukturen att kontinuerligt genomgå strängförskjutnings- och förlängningsreaktioner, och slutligen bilda multipla stam-loop-strukturer med olika längder.DNA-blandning.

Fördelar och nackdelar med loop-medierad isotermisk förstärkning

Fördelar med LAMPA:

(1) Hög amplifieringseffektivitet, som effektivt kan amplifiera 1-10 kopior av målgenen inom 1 timme, och amplifieringseffektiviteten är 10-100 gånger den för vanlig PCR.

(2) Reaktionstiden är kort, specificiteten är stark och ingen speciell utrustning krävs.

Brister med LAMP:

(1) Kraven på primers är särskilt höga.

(2) Den amplifierade produkten kan inte användas för kloning och sekvensering, utan kan endast användas för bedömning.

(3) På grund av dess starka känslighet är det lätt att bilda aerosoler, vilket orsakar falska positiva resultat och påverkar testresultaten.

STrådförskjutningsförstärkning

Strandförskjutningsamplifiering (SDA) är en in vitro isotermisk DNA-amplifieringsteknik baserad på enzymatisk reaktion som först föreslogs av den amerikanske forskaren Walker 1992.

Det grundläggande systemet för SDA inkluderar ett restriktionsendonukleas, ett DNA-polymeras med strängförskjutningsaktivitet, två par primrar, dNTPs och kalcium- och magnesiumjoner och buffertsystem.

Principen för strängförskjutningsamplifiering är baserad på den kemiskt modifierade restriktionsendonukleasigenkänningssekvensen vid båda ändarna av mål-DNA:t.Endonukleaset öppnar gapet i DNA-strängen vid dess igenkänningsställe, och DNA-polymeraset förlänger gapet 3′ End och ersätter nästa DNA-sträng.

De ersatta enkelsträngarna av DNA kan kombineras med primrar och förlängas till dubbelsträngar med DNA-polymeras.Denna process upprepas kontinuerligt, så att målsekvensen amplifieras effektivt.

Fördelar och nackdelar med strängförskjutningsförstärkningsteknik

Fördelar med SDA:

Amplifieringseffektiviteten är hög, reaktionstiden är kort, specificiteten är stark och ingen speciell utrustning krävs.

Brister med SDA:

Produkterna är inte enhetliga, och vissa enkelsträngade och dubbelsträngade produkter produceras alltid i SDA-cykeln, och svansbildning kommer oundvikligen att inträffa när de detekteras genom elektrofores.

Rollingcirkelförstärkning

Rullande cirkelamplifiering (RCA) föreslås genom att använda metoden att kopiera DNA från patogena organismer genom att rulla cirkel.Det hänvisar till användningen av enkelsträngat cirkulärt DNA som en mall vid en konstant temperatur och ett speciellt DNA-polymeras (som Phi29) ) Under verkan av rullande cirkel-DNA-syntes för att uppnå amplifieringen av målgenen.

RCA kan delas in i linjär förstärkning och exponentiell förstärkning.Effektiviteten för linjär RCA kan nå 10⁵gånger, och effektiviteten för exponentiell RCA kan nå 10⁹gånger.

Enkel distinktion, som visas i figuren nedan, använder linjär amplifiering a endast 1 primer, exponentiell amplifiering b har 2 primers.

Linjär RCA kallas även singel primer RCA.En primer binder till cirkulärt DNA och förlängs genom verkan av DNA-polymeras.Produkten är en linjär enkelsträng med ett stort antal repetitiva sekvenser tusentals gånger längden på en enda slinga.

Eftersom produkten av linjär RCA alltid är ansluten till startprimern är den enkla fixeringen av signalen en stor fördel.

Exponentiell RCA, även känd som Hypergrenad amplification HRCA (Hyper branched RCA), i exponentiell RCA, en primer amplifierar RCA-produkten, den andra primern hybridiserar med RCA-produkten och sträcker sig, och ersättningen är redan bunden till RCA-produkten. Nedströmsprimrarna förlänger strängen, och upprepar förlängning och ersättning för att producera en dendritisk produkt.

Fördelarna och nackdelarna med nukleinsyraamplifiering i rullande cirkel

Fördelar med RCA:

Hög känslighet, bra specificitet och enkel användning.

Brister med RCA:

Bakgrundsproblem under signaldetektering.Under RCA-reaktionen kan den ocirkulerade hänglåsproben och mall-DNA eller RNA från den obundna sonden generera vissa bakgrundssignaler. 

Nukleinsyrasekvensbaserad amplifiering

Nukleinsyrasekvensbaserad amplifiering (NASBA) är en ny teknologi utvecklad på basis av PCR.Det är en kontinuerlig och isotermisk nukleinsyraamplifiering som styrs av ett par primrar med en T7-promotorsekvens.Tekniken kan amplifiera mall-RNA:t med cirka 109 gånger på cirka 2 timmar, vilket är 1000 gånger högre än den konventionella PCR-metoden och kräver ingen speciell utrustning.

Denna teknik har använts för snabb diagnos av sjukdomar så snart den dök upp, och många företag använder för närvarande denna metod i RNA-detektionskit.

Även om RNA-amplifiering också kan använda PCR-teknik för omvänd transkription, har NASBA sina egna fördelar: den kan utföras under relativt konstanta temperaturförhållanden och den är mer stabil och exakt än traditionell PCR-teknik.

Reaktionen är vid 41 grader Celsius och kräver AMV (aviärt myeloblastosvirus) omvänt transkriptas, RNas H, T7 RNA-polymeras och ett par primers för att fullborda.

Processen omfattar huvudsakligen:

Den framåtriktade primern innehåller den komplementära sekvensen för T7-promotom.Under reaktionen binder den framåtriktade primern till RNA-strängen och katalyseras av AMV-enzymet för att bilda en DNA-RNA-dubbelsträng.

RNas H digererar RNA:t i hybriddubbelsträngen och behåller det enkelsträngade DNA:t.

Under verkan av den omvända primern och AMV-enzymet bildas en dubbelsträng av DNA som innehåller T7-promotorsekvensen.

Under verkan av T7 RNA-polymeras fullbordas transkriptionsprocessen och en stor mängd mål-RNA produceras.

Fördelar med NASBA:

(1) Dess primer har en T7-promotorsekvens, men det främmande dubbelsträngade DNA:t har ingen T7-promotorsekvens och kan inte amplifieras, så denna teknologi har hög specificitet och känslighet.

(2) NASBA inkorporerar direkt omvänd transkriptionsprocessen i amplifieringsreaktionen, vilket förkortar reaktionstiden.

Nackdelar med NASBA:

(1) Reaktionskomponenterna är mer komplicerade.

(2) Tre sorters enzymer krävs för att göra reaktionskostnaden högre.