• Facebook
  • linkedin
  • Youtube

Att verifiera prestandan hos primrar och prober i det tidiga skedet av PCR-reagens och bestämma de mest lämpliga reaktionsförhållandena är förutsättningarna för att säkerställa ett smidigt framsteg av formella experiment.

Så hur behöver vi bekräfta primerproben i ett tidigt skede?

Huvudindikatorerna är baslinje, amplifieringskurva, ct-värde, amplifieringseffektivitet, lågkoncentrationsprovdetektion, CV, etc.

Baslinje

Baslinjen är den horisontella linjen i PCR-amplifieringskurvan.Under de första cyklerna av PCR-amplifieringsreaktionen förändras inte fluorescenssignalen mycket och bildar en rak linje.Denna räta linje är baslinjen.

När du screenar PCR-primerprober, var uppmärksam på om baslinjen är jämn.Renheten hos primerprobens koncentration kommer att påverka baslinjen, såsom att orsaka att baslinjen stiger eller faller.Baslinjen är också en mycket intuitiv indikator.
Analys

Amplifieringskurva

En annan intuitiv indikator är formen på förstärkningskurvan.Det är bäst att ha en S-formad kurva för att undvika sekundär amplifiering eller andra onormala amplifieringskurvor.
null

Ct-värde

Antalet cykler som motsvarar vändpunkten från baslinjen till den exponentiella tillväxten är Ct-värdet.

För samma prov resulterar olika primerprober i olika amplifieringskurvor, och motsvarande Ct-värde kommer att påverkas av amplifieringseffektiviteten och interferensgraden.I teorin, ju mindre Ct-värdet för primerproben vi väljer, desto bättre.

Analys-3

Amplifieringseffektivitet

En av de mest tillförlitliga och stabila metoderna för att utvärdera PCR-amplifieringseffektiviteten är standardkurvan, som också är allmänt erkänd av forskare.Metoden innebär att man gör en serie prover för att kontrollera det relativa antalet målmallar.Dessa prover görs vanligtvis genom serieutspädningar av koncentrerade stamlösningar, den vanligaste är 10-faldig spädning.Använd en serie utspädda prover, använd standardprogrammet qPCR för att amplifiera för att erhålla Cq-värdet, och rita slutligen en standardkurva enligt koncentrationen av varje prov och motsvarande Cq-värde för att erhålla den linjära ekvationen Cq= -klgX0+b, och amplifieringseffektiviteten E=10(-1 /k)-1.När qPCR används för kvantitativ analys krävs att amplifieringseffektiviteten ligger inom intervallet 90%-110% (3,6>k>3,1).

Analys-4

Lågkoncentrationsprovdetektion

När provkoncentrationen är låg är detektionshastigheterna för olika primerprober olika.Vi väljer ut 20 lågkoncentrationsprover för att replikera, och primer-probsystemet med den högsta detektionshastigheten är det bästa.

Analys-5

Variationskoefficient (CV)

10 dubbla prover kan detekteras med olika primerprober enligt linjestandarden för reagenset för detektion av nukleinsyraamplifiering.

Analys-6

Kvantitativa reagenser:
Noggrannhet
Noggrannheten inom en batch bör uppfylla: variationskoefficienten (CV,%) av det logaritmiska värdet för testkoncentrationen är ≤5%.När provkoncentrationen är låg är variationskoefficienten (CV,%) för logaritmen för detektionskoncentrationen ≤10 %


Kvalitativa reagenser:
Noggrannhet
Noggrannheten inom en batch bör uppfylla:

(1) Variationskoefficient för Ct-värde (CV,%) ≤5%

Samma prov testas parallellt i 10 gånger, och testresultaten bör vara konsekventa


Posttid: 2021-09-18