I ett tidigt skede av utbrottet, på grund av den snabba utvecklingen, är snabb diagnos av misstänkta patienter nyckeln till att förebygga covid-19.Vissa godkända nukleinsyradetekteringsreagenser har en kort utvecklingstid, och det finns problem som snabb prestandabekräftelse, otillräcklig reagensoptimering och stora skillnader mellan batcher;Problemen med olika kliniska laboratorier i olika aspekter av nukleinsyradetekteringsprocessen kan också påverka noggrannheten av nukleinsyradetekteringsresultat.Den här artikeln kommer att fokusera på nyckellänkarna och punkterna i den aktuella nukleinsyradetekteringen av SARS-CoV-2, och analysera problemen med falsk negativ och positiv omprövning av nukleinsyradetektering i laboratoriet och klinisk inkonsekvens.

Principer för SARS-CoV-2-nukleinsyradetektion

SARS-CoV-2 är ett RNA-virus med en genomsekvens på cirka 29 kb, med 10 gener, som effektivt kan koda för 10 proteiner.Virus består av RNA och protein, och det yttersta lagret är en yttre beläggning som består av lipider och glykoproteiner.Inuti lindar proteinkapsiden in RNA:t i sig och skyddar därigenom det lättnedbrytbara RNA:t (P1).

P1 Struktur för SARS-COV-2

Virus invaderar celler genom specifika cellytreceptorer för att orsaka infektion och använder värdceller för att replikera.

Principen för viral nukleinsyradetektion är att exponera det virala RNA:t genom ett cellysat och sedan använda fluorescerande omvänd transkription-polymeraskedjereaktion i realtid (RT-PCR) för detektion.

Nyckeln till detektionsprincipen är att använda primrar och prober för att uppnå "riktad matchning" av nukleinsyrasekvenser, det vill säga att hitta nukleinsyrasekvensen för SARS-CoV-2 som skiljer sig från andra virus i cirka 30 000 baser (likheten mellan nukleinsyra och andra virus) "lågt" område), designa primrar och prober.

Primrarna och proberna är mycket matchade med den specifika regionen av SARS-CoV-2-nukleinsyra, det vill säga specificiteten är mycket stark.När det fluorescerande RT-PCR-amplifieringsresultatet i realtid för provet som ska testas är positivt, bevisar det att SARS-CoV-2 finns i provet.Se P2.

P2 Steg för SARS-CoV-2 nukleinsyrabestämning (fluorescerande RT-PCR i realtid)

Villkor och krav för laboratoriet för nukleinsyradetektering av SARS-CoV-2

Nukleinsyratestlaboratorier är de mest idealiska för miljöer med negativt tryck, och de bör vara uppmärksamma på tryckövervakning, hålla luftflödet och eliminera aerosoler.Nukleinsyratestare måste ha motsvarande kvalifikationer, få relevant utbildning i polymeraskedjereaktion och klara bedömningen.Laboratoriet bör styras strikt, indelas i zoner och irrelevant personal är strängt förbjuden att komma in.Det rena området bör ventileras och desinficeras på plats.Relevanta föremål placeras i zoner, rena och smutsiga separeras, byts ut i tid och dekontamineras på plats.Rutindesinfektion: Klorhaltigt desinfektionsmedel är huvudlösningen för större ytor, och 75 % alkohol kan användas för små ytor.Ett bra sätt att hantera aerosoler är att öppna fönster för ventilation, och luftdesinfektion kan även utföras med hjälp av ultravioletta strålar, filtrering och luftdesinfektion.

Nyckellänkar och parametrar för SARS-CoV-2-nukleinsyrabestämning (fluorescerande RT-PCR i realtid)

Även om laboratorier i allmänhet ägnar stor uppmärksamhet åt "detektion av nukleinsyra", är "extraktion" av nukleinsyra faktiskt också ett av nyckelstegen för framgångsrik detektion, vilket är nära relaterat till insamling och lagring av virusprover.

För närvarande använder de mest använda andningsproverna, såsom nasofaryngeala pinnprover, den andra metoden, som är en inaktiveringslösning (konservering) framställd baserad på nukleinsyraextraktion och lyslösning.Å ena sidan kan denna viruskonserveringslösning denaturera virusets protein, förlora sin aktivitet och inte längre vara smittsam, och förbättra säkerheten i transport- och upptäcktsstadiet;å andra sidan kan den direkt knäcka viruset för att frigöra nukleinsyran, eliminera det nukleinsyranedbrytande enzymet och förhindra viruset.RNA:t bryts ned.

En virusprovtagningslösning framställd på basis av nukleinsyraextraktionslyslösning.Huvudkomponenterna är balanserade salter, etylendiamintetraättiksyrakelateringsmedel, guanidinsalt (guanidinisotiocyanat, guanidinhydroklorid, etc.), anjonisk tensid (dodekan) Natriumsulfat), katjonisk tensid (tetradecyltrimetylammoniumoxalat), dithiotreinol och flera andra komponenter, dithi-hydroxinool, K.För närvarande finns det många typer av nukleinsyraextraktionssatser, och olika nukleinsyraextraktions- och reningsreagenser används.Även om samma nukleinsyraextraktions- och reningsreagens används, är extraktionsprocedurerna för varje kit olika.

För närvarande väljs nukleinsyradetektionsprodukterna som godkänts av National Medical Products Administration baserat på ORF1ab-, E- och N-generna i SARS-CoV-2-genomet.Detektionsprinciperna för olika produkter är i princip desamma, men deras primers och sonddesign är olika.Det finns enmålssegment (ORF1ab), dubbla målsegment (ORF1ab, N eller E) och tremålssegment (ORF1ab, N och E).Skillnaden mellan detektion och tolkning, nukleinsyraextraktion och fluorescerande RT-PCR-reaktionssystem i realtid bör hänvisa till de relevanta kitinstruktionerna, och det rekommenderas att användarna strikt följer tolkningsmetoden som specificeras i kitinstruktionerna för tolkning.De vanliga regionerna, primrarna och probsekvenserna amplifierade med fluorescerande RT-PCR i realtid visas i P3.

P3 Placeringen av SARS-CoV-2 amplikonmålet på genomet och sekvensen av primrar och prober

Tolkning av resultaten av SARS-CoV-2 nukleinsyrabestämning (Räl-Time fluorescerande RT-PCR)

"Pneumonia Prevention and Control Plan for SARS-CoV-2 Infection (Andra upplagan)" klargjorde för första gången kriterierna för att bedöma resultaten av enkel genamplifiering:

1. Ingen Ct eller Ct≥40 är negativ;

2. Ct<37 är positivt;

3. Ct-värdet på 37-40 är gråskaleområdet.Det rekommenderas att upprepa experimentet.Om resultatet av att göra om Ct<40 och amplifieringskurvan har uppenbara toppar, bedöms provet som positivt, annars är det negativt.”

Den tredje upplagan av guiden och den fjärde upplagan av guiden fortsatte ovanstående kriterier.Men på grund av de olika mål som används i kommersiella kit, gav den tidigare nämnda tredje upplagan av guiden inte kriterierna för att bestämma kombinationen av mål, vilket betonar att instruktionerna från tillverkaren ska ha företräde.Från och med den femte upplagan av riktlinjerna har två mål förtydligats, särskilt bedömningskriterierna för ett enskilt mål som är svårt att bedöma.Det vill säga, om laboratoriet vill bekräfta att ett fall är positivt för SARS-CoV-2 nukleinsyradetektering, måste följande uppfyllas 1 av 2 villkor:

(1) Två mål av SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) i samma prov testas positiva med fluorescerande RT-PCR i realtid.Om ett enskilt mål är positivt krävs omprovtagning och omtestning.Om testresultaten är Om det enskilda målet fortfarande är positivt bedöms det som positivt.

(2) Två prover av realtidsfluorescerande RT-PCR visade ett enda mål positivt samtidigt eller två prover av samma typ visade ett enda målpositivt testresultat, vilket kan bedömas som positivt.Riktlinjerna betonar dock också att de negativa resultaten av nukleinsyratestning inte kan utesluta SARS-CoV-2-infektion.Faktorer som kan orsaka falsknegativ måste uteslutas, inklusive dålig provkvalitet (andningsprov från orofarynx och andra delar), provtagning för tidigt eller för sent, prover förvarades inte, transporterades och bearbetades inte korrekt, och själva tekniken hade problem (virusvariation, PCR-hämning), etc.

Orsaker till falskt negativ i SARS-CoV-2-detekteringen

Begreppet "falskt negativt" i nukleinsyratester som för närvarande är aktuellt hänvisar ofta till "falskt negativa" där nukleinsyratestresultaten inte överensstämmer med kliniska manifestationer, det vill säga kliniska symtom och avbildningsresultat är mycket misstänkta för covid-19, men nukleinsyratester är alltid "negativa" många gånger.National Health Commissions kliniska laboratoriecenter förklarade det "falskt negativa" SARS-CoV-2-testet.

(1) Det finns en viss mängd virus i cellerna hos den infekterade personen.Befintliga data visar att efter att kroppen har infekterats av viruset kommer viruset in i halsen genom näsan och munnen, sedan till luftstrupen och bronkerna och når sedan alveolerna.Den smittade personen kommer att uppleva inkubationstiden, milda symtom och sedan processen med allvarliga symtom och olika stadier av sjukdomen.Och mängden virus som finns i olika delar av kroppen är olika.

När det gäller virusmängden av celltyper, alveolära epitelceller (nedre luftvägarna)> luftvägsepitelceller (övre luftvägarna)> fibroblaster, endotelceller och makrofager, etc.;från provtypen, alveolär sköljvätska (den mest utmärkta)>djupt hostande sputum>nasofarynxpinne>orofarynxpinne>blod.Dessutom kan viruset även påvisas i avföring.Men med tanke på bekvämligheten av operationen och acceptansen av patienter, är den vanligaste kliniska provordningen orofaryngeal pinnprover>nasofaryngeal pinne> bronkial sköljvätska (komplex operation) och djupt sputum (vanligtvis torr hosta, svår att få).

Därför är mängden virus i cellerna i orofarynx eller nasofarynx hos vissa patienter liten eller extremt låg.Om endast prover av orofarynx eller nasofarynx tas för testning, kommer den virala nukleinsyran inte att detekteras.

(2) Inga virusinnehållande celler samlades in under provtagningen, eller så bevarades inte viral nukleinsyra effektivt.

[① Felaktig insamlingsplats, till exempel vid insamling av orofaryngeala pinnprover, är uppsamlingsdjupet inte tillräckligt, de insamlade nasofarynxproverna samlas inte in djupt i näshålan, etc. De flesta celler som samlas in kan vara virusfria celler;

②Samplingar för provtagning används felaktigt.Till exempel rekommenderas syntetiska fibrer som PE-fiber, polyesterfiber och polypropenfiber för materialet på svabbhuvudet.Naturliga fibrer som bomull används i verklig drift (stark adsorption av protein och inte lätt att tvätta ur) och nylonfibrer (dålig vattenabsorption, vilket leder till otillräcklig provtagningsvolym);

③Felaktig användning av viruslagringsrör, såsom felaktig användning av förvaringsrör av polypropen eller polyetenplast som är lätta att absorbera nukleinsyror (DNA/RNA), vilket resulterar i en minskning av koncentrationen av nukleinsyra i lagringslösningen.I praktiken rekommenderas att använda polyeten-propenpolymerplast och några specialbehandlade polypropenplastbehållare för att lagra virala nukleinsyror.]

[① Felaktig insamlingsplats, till exempel vid insamling av orofaryngeala pinnprover, är uppsamlingsdjupet inte tillräckligt, de insamlade nasofarynxproverna samlas inte in djupt i näshålan, etc. De flesta celler som samlas in kan vara virusfria celler;

②Samplingar för provtagning används felaktigt.Till exempel rekommenderas syntetiska fibrer som PE-fiber, polyesterfiber och polypropenfiber för materialet på svabbhuvudet.Naturliga fibrer som bomull används i verklig drift (stark adsorption av protein och inte lätt att tvätta ur) och nylonfibrer (dålig vattenabsorption, vilket leder till otillräcklig provtagningsvolym);

③Felaktig användning av viruslagringsrör, såsom felaktig användning av förvaringsrör av polypropen eller polyetenplast som är lätta att absorbera nukleinsyror (DNA/RNA), vilket resulterar i en minskning av koncentrationen av nukleinsyra i lagringslösningen.I praktiken rekommenderas att använda polyeten-propenpolymerplast och några specialbehandlade polypropenplastbehållare för att lagra virala nukleinsyror.]

(4) Den kliniska laboratorieverksamheten är inte standardiserad.Provtransport- och lagringsförhållanden, standardiserad drift av kliniska laboratorier, resultattolkning och kvalitetskontroll är nyckelfaktorerna för att säkerställa testresultatens noggrannhet och tillförlitlighet.Enligt resultaten från den externa kvalitetsutvärderingen som genomfördes av Clinical Laboratory Center vid National Health Commission den 16-24 mars 2020, av de 844 laboratorier som fick giltiga resultat, var 701 (83,1%) kvalificerade och 143 (16,9%) inte.Kvalificerad, de övergripande laboratorietestförhållandena är goda, men olika laboratorier har fortfarande skillnader i personalens operationsförmåga, förmåga att tolka ett positivt prov med ett mål och kvalitetskontroll.

Hur minskar man det falska negativa av SARS-CoV-2 nukleinsyradetektering?

Minskning av falska negativ i nukleinsyradetektion bör optimeras utifrån de fyra aspekterna av att producera falsknegativ.

(1) Det finns en viss mängd virus i cellerna hos den infekterade personen.Koncentrationen av viruset i olika delar av kroppen hos misstänkta smittade personer kommer att vara olika vid olika tidpunkter.Om det inte finns något svalg kan det vara i bronkial sköljvätska eller avföring.Om flera typer av prover kan samlas in samtidigt eller vid olika stadier av sjukdomsprogression för testning, hjälper det till att undvika falska negativa resultat.

(2) Celler som innehåller virus bör samlas in under provtagningen.Detta problem kan i stor utsträckning lösas genom att stärka utbildningen av provsamlare.

(3) Pålitliga IVD-reagenser.Genom att utföra forskning om utvärdering av detektionsprestanda av reagenser på nationell nivå, och diskutera de befintliga problemen, kan detektionseffektiviteten för reagenser förbättras ytterligare och analysens känslighet kan förbättras.

(4) Standardiserad drift av kliniska laboratorier.Genom att stärka utbildningen av laboratoriepersonal, kontinuerligt förbättra laboratoriets kvalitetsledningssystem, säkerställa rimliga uppdelningar och förbättra personalens förmåga att upptäcka, är det möjligt att minska falska negativa resultat på grund av felaktig laboratorieverksamhet.

Skäl för att testa positivt på SARS-CoV-2-nukleinsyratestet hos återställda och utskrivna patienter

"Covid-19 Diagnosis and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)" stipulerar tydligt att ett av kriterierna för att covid-19-patienter ska bli botade och utskrivna från sjukhuset är att två på varandra följande luftvägsprover har ett negativt nukleinsyratest (minst 24 timmars mellanrum), men det finns väldigt få SARS-CoV-2-patienter på grund av att flera nukleinsyratest återigen var positiva på grund av att olika nukleinsyratest var positiva.

(1)SARS-CoV-2 är ett nytt virus.Det är nödvändigt att ytterligare förstå dess patogena mekanism, den fullständiga bilden av den orsakade sjukdomen och egenskaperna hos sjukdomsförloppet.Därför är det å ena sidan nödvändigt att stärka hanteringen av utskrivna patienter och genomföra 14-dagars medicinsk observation.Genomför uppföljning, hälsoövervakning och hälsovägledning för att fördjupa förståelsen för hela processen av sjukdomens uppkomst, utveckling och utfall.

(2) Patienten kan bli infekterad med viruset igen.Akademikern Zhong Nanshan sa: Eftersom botade patienter har antikroppar kan SARS-CoV-2 elimineras av antikroppar när de invaderar igen.Det finns många orsaker, som kan vara orsaken till den återhämtade patienten, eller det kan vara relaterat till mutationen av viruset, eller till och med orsaken till laboratorietester.Om det är viruset i sig kan SARS-CoV-2-mutationen göra att antikroppen som produceras av den tillfrisknade patienten blir ineffektiv mot det muterade viruset.Om patienten infekteras med det muterade viruset igen kan nukleinsyratestet bli positivt igen.

(3) När det gäller laboratorietestmetoder har varje testmetod sina begränsningar.Nukleinsyradetektering av SARS-CoV-2 beror på valet av gensekvens, reagenssammansättningen, metodens känslighet och andra orsaker, vilket leder till att de befintliga kiten har sina egna nedre detektionsgränser.Efter att patienten har behandlats minskar viruset i kroppen.När virusmängden i provet som ska testas är under den nedre detektionsgränsen, visas ett "negativt" resultat.Detta resultat betyder dock inte att viruset i kroppen helt har försvunnit.Viruset kan vara efter att behandlingen har avbrutits.Resurgence”, fortsätt att kopiera.Därför rekommenderas att se över en gång i veckan inom 2 till 4 veckor efter utskrivning.

(4) Nukleinsyra är virusets genetiska material.Viruset dödas efter att patienten har genomgått antiviral behandling, men de återstående virala RNA-fragmenten finns fortfarande kvar i människokroppen och släpps inte ut helt från kroppen.Ibland, under vissa omständigheter, kan den behållas mer.En lång tid, och vid denna tidpunkt kommer nukleinsyratestet att vara "övergående" positivt.Med förlängningen av patientens återhämtningstid, efter att de kvarvarande RNA-fragmenten i kroppen gradvis uttömts, kan nukleinsyratestresultatet bli negativt.

(5) Nukleinsyratestresultatet av SARS-CoV-2 bevisar endast närvaron eller frånvaron av viralt RNA och kan inte bevisa virusets aktivitet och om viruset är överförbart.Det är nödvändigt att bevisa om en patient som har ett positivt nukleinsyratest igen kommer att bli en infektionskälla igen.Det är nödvändigt att utföra virusodling på kliniska prover och odla ett "levande" virus för att bevisa att det är smittsamt.

Sammanfattning

Sammanfattningsvis kan SARS-CoV-2-nukleinsyratesta falska negativa, positiva omtestning och andra tillstånd som inte är förenliga med kliniska manifestationer helt undvikas.Vid faktisk screening och testning rekommenderas att kombinera kliniska symtom, bildundersökningar (CT) och experiment Laboratorietest (nukleinsyratest + virusspecifikt antikroppstest) resultat för omfattande diagnos för att förhindra missad diagnos och feldiagnos.Om testresultaten visar sig vara uppenbart oförenliga med de kliniska manifestationerna, rekommenderas det att göra en omfattande analys av hela testlänken (provtagning, cirkulation och bearbetningslänkar) för att utesluta SARS-CoV-2-virus tidig infektion, återkommande infektion eller kombinerad med andra luftvägsvirusinfektioner, etc. möjligt.Om förhållandena tillåter rekommenderas det att samla in känsligare prover som sputum eller alveolär sköljvätska för ny undersökning.

Relaterade produkter:

SARS-CoV-2 nukleinsyradetektionskit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)