Inga förstärkningssignaler

1. Taq DNA-polymeraset i kitet förlorar sin aktivitet på grund av felaktig förvaring eller utgång av kitet.
Rekommendation: Bekräfta förvaringsvillkoren för kitet;tillsätt igen en lämplig mängd Taq DNA-polymeras till PCR-systemet eller köp ett nytt PCR-kit i realtid för relaterade experiment.

2. Det finns många hämmare av Taq DNA-polymeras i DNA-mallen.
Förslag: Rensa mallen igen eller minska mängden mall som används.

3. Mg2+-koncentrationen är inte lämplig.
Rekommendation: Mg2+-koncentrationen av den 2× Real PCR-blandning vi tillhandahåller är 3,5 mM.Men för vissa speciella primers och mallar kan Mg2+-koncentrationen vara högre.Därför kan du direkt lägga till MgCl2 för att optimera Mg2+-koncentrationen.Det rekommenderas att öka Mg2+ 0,5 mM varje gång för optimering.

4. PCR-amplifieringsförhållandena är inte lämpliga och primersekvensen eller koncentrationen är felaktig.
Förslag: bekräfta att primersekvensen är korrekt och att primern inte har brutits ned;Om förstärkningssignalen inte är bra, försök att sänka anlöpningstemperaturen och justera primerkoncentrationen på lämpligt sätt.

5. Mängden mall är för liten eller för mycket.
Rekommendation: Utför malllineariseringsgradientspädning och välj mallkoncentrationen med den bästa PCR-effekten för realtids-PCR-experiment.

NTC har för högt fluorescensvärde

1. Reagenskontamination orsakad under drift.
Rekommendation: Ersätt med nya reagenser för realtids-PCR-experiment.

2. Kontaminering inträffade under beredningen av PCR-reaktionssystemet.
Rekommendation: Vidta nödvändiga skyddsåtgärder under drift, såsom: bära latexhandskar, använda pipettspets med filter, etc.

3. Primerna bryts ned och nedbrytningen av primrarna kommer att orsaka ospecifik amplifiering.
Förslag: Använd SDS-PAGE-elektrofores för att detektera om primrarna är nedbrutna och ersätt dem med nya primers för realtids-PCR-experiment.

Primer-dimer eller icke-specifik amplifiering

1. Mg2+-koncentrationen är inte lämplig.
Rekommendation: Mg2+-koncentrationen av den 2× Real PCR EasyTM Mix vi tillhandahåller är 3,5 mM.Men för vissa speciella primers och mallar kan Mg2+-koncentrationen vara högre.Därför kan du direkt lägga till MgCl2 för att optimera Mg2+-koncentrationen.Det rekommenderas att öka Mg2+ 0,5 mM varje gång för optimering.

2. PCR-glödgningstemperaturen är för låg.
Förslag: Öka PCR-glödgningstemperaturen med 1 ℃ eller 2 ℃ varje gång.

3. PCR-produkten är för lång.
Rekommendation: Längden på realtids-PCR-produkten bör vara mellan 100-150 bp, inte mer än 500 bp.

4. Primerna bryts ned och nedbrytningen av primrarna kommer att leda till uppkomsten av specifik amplifiering.
Förslag: Använd SDS-PAGE-elektrofores för att detektera om primrarna är nedbrutna och ersätt dem med nya primers för realtids-PCR-experiment.

5. PCR-systemet är felaktigt, eller så är systemet för litet.
Förslag: PCR-reaktionssystemet är för litet gör att detektionsnoggrannheten minskar.Det är bäst att använda reaktionssystemet som rekommenderas av det kvantitativa PCR-instrumentet för att köra realtids-PCR-experimentet igen.

Dålig repeterbarhet av kvantitativa värden

1. Instrumentet fungerar inte.
Förslag: Det kan finnas fel mellan varje PCR-hål i instrumentet, vilket resulterar i dålig reproducerbarhet under temperaturhantering eller detektering.Kontrollera enligt instruktionerna för motsvarande instrument.

2. Provets renhet är inte bra.
Rekommendation: Orena prover kommer att leda till dålig reproducerbarhet av experimentet, vilket inkluderar renheten av mallen och primers.Det är bäst att återrena mallen, och primrarna renas bäst med SDS-PAGE.

3. Förberedelse- och lagringstiden för PCR-systemet är för lång.
Förslag: Använd PCR-systemet i realtid för PCR-experiment omedelbart efter beredning, och låt det inte stå åt sidan för länge.

4. PCR-amplifieringsförhållandena är inte lämpliga och primersekvensen eller koncentrationen är felaktig.
Förslag: bekräfta att primersekvensen är korrekt och att primern inte har brutits ned;Om förstärkningssignalen inte är bra, försök att sänka anlöpningstemperaturen och justera primerkoncentrationen på lämpligt sätt.

5. PCR-systemet är felaktigt, eller så är systemet för litet.
Förslag: PCR-reaktionssystemet är för litet gör att detektionsnoggrannheten minskar.Det är bäst att använda reaktionssystemet som rekommenderas av det kvantitativa PCR-instrumentet för att köra realtids-PCR-experimentet igen.